多光子成像在乳腺癌诊断和预后评测的应用

乳腺癌是全球女性中最常见的恶性肿瘤，其发病率居高不下，严重威胁着女性的健康。近年来，随着医学成像技术的不断进步，多光子显微技术（MPM）作为一种先进的医学成像手段，逐渐在乳腺癌的诊断和预后预测中展现出巨大的潜力。

研究背景与技术挑战
乳腺癌的全球现状
乳腺癌长期以来占据全球女性恶性肿瘤发病率的首位。根据国际癌症研究机构（IARC）最新发布的2020年全球癌症负担数据，乳腺癌的发病数已经超过肺癌，成为全球第一大癌症。乳腺癌的高度异质性使得患者的个体差异显著，因此，如何准确预测乳腺癌的生物学行为，成为临床治疗中的一大挑战。

技术挑战
尽管多光子显微技术在成像分辨率、无标记、免切片、光学层析成像等方面具有显著优势，但其在乳腺癌预后预测中的应用仍面临诸多挑战。首先，乳腺癌的微环境复杂，包含多种细胞和基质成分，如何准确识别和量化这些成分的变化是一个难题。其次，现有的预后预测模型主要依赖于肿瘤细胞的形态学和分子表达信息，忽略了肿瘤微环境在肿瘤发生、发展和转移中的重要作用。因此，开发一种能够综合考虑肿瘤微环境特征的预后预测系统，成为当前研究的重点。

技术创新与应用
多光子显微技术的原理创新
多光子显微技术的核心创新是基于的非线性光学效应，即双光子激发荧光（TPEF）和二次谐波（SHG）。双光子激发荧光是一个三阶非线性吸收过程。在这个过程中，一个荧光分子或者原子同时吸收两个相同频率的光子，独特的激发方式使得双光子激发荧光具有更高的空间分辨率和更深的成像深度，能够在不破坏组织的情况下对深层组织进行成像。

二次谐波是一种二阶非线性光学现象，也称为 “倍频”。当具有相同频率的两个光子与非线性介质相互作用时，其输出光子频率为入射光子频率的二倍，这个输出的二倍频光波就是二次谐波。二次谐波的产生与介质的二阶极化率密切相关，而二阶极化率又与介质本身的特性，如电子态、分子对称性、旋向及排列等有关。因此，二次谐波可以作为一种灵敏的组织材料特性指标，反映介质的微观结构特性。
在乳腺肿瘤研究中的应用优势

多光子显微技术在乳腺肿瘤微环境研究中无需外源性染色剂，就能对各种组分进行成像，避免了染色剂对组织的干扰和损伤。该技术具有光学层析成像能力，可以实现对组织的三维成像，全面观察肿瘤微环境的结构和组成。多光子显微技术能够反映细胞的功能代谢信息，通过分析细胞的荧光信号强度和光谱特征，可以了解细胞的代谢状态和功能活性。此外，还具有三维靶向消融能力、较低的光漂白与光损伤以及高成像对比度等优势，为乳腺癌的研究和诊断提供了有力的工具。

成像实验与结果分析
胶原纤维成像结果及分析
形态特征分析：通过对胶原纤维的SHG成像，直接从多光子显微图像上分析其形态特征。Han等利用胶原纤维SHG光的偏振性和方向性，确定了小鼠乳腺肿瘤模型中胶原蛋白与健康乳腺脂肪垫间的结构关系。研究发现，产生SHG的胶原亚群不受肿瘤间质胶原合成改变的影响，且受到异常降解环境的保护。通过对正向和反向传播SHG信号的比值进行定量分析，能够监测整个导管和小叶癌发展过程中的胶原纤维变化。Natal等对不同类型浸润性乳腺癌患者的组织切片进行SHG成像并评价胶原参数，结果表明通过胶原参数可以识别出三种主要的乳腺癌组。研究小组将这种胶原纤维重塑特征定义为肿瘤相关胶原纤维特征（TACS1-3）。

计算机辅助图像分析：Falzon等利用SHG成像对正常和病变乳腺组织中的胶原纤维形态改变进行定性分析，并采用椭圆傅里叶分析量化相关指标来区分乳腺肿瘤的性质。Bredfeldt等利用大视场高分辨率显微镜技术、图像处理和监督学习方法，半自动化地量化胶原纤维排列特征，实现了TACS候选生物标志物的半自动采集和分析，其量化得分可准确预测乳腺癌患者的生存期。Majeed等利用新的无标记定量相位成像技术，更快速地提取胶原纤维定向排列信息以反映乳腺疾病的不同分期。

Natal等通过SHG成像量化管腔型乳腺肿瘤患者瘤周与瘤内胶原纤维特征差异，发现较高的瘤内胶原纤维一致性与较高的病理分期和腋窝淋巴结转移相关。Gole等采用基于双模式高斯混合模型（GMM）的计算机辅助图像分析方法，细化胶原纤维特征，比较不同定量参数对三阴性乳腺癌预后的价值。Sprague等基于curvelet变化算法更全面地提取乳腺导管原位癌病变周围胶原纤维的形态特征，这些特征与乳腺导管原位癌的复发风险相关。Xi等采用基于高斯混合模型的分割算法和纤维网络提取算法等，建立的TCMF-score具有较强的预后性能，对所有乳腺癌患者都有很好的预后预测能力。

肿瘤浸润淋巴细胞成像结果及分析
肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）是肿瘤微环境的重要组成部分，与乳腺癌患者预后密切相关，可分为间质肿瘤浸润淋巴细胞（sTILs）和上皮内肿瘤浸润淋巴细胞（iTILs）。不同研究表明，高密度TILs浸润对不同分子亚型的乳腺癌预后影响不同，对ER阴性的三阴性乳腺癌及HER2过表达型乳腺癌有较好预后，而对ER阳性的管腔型患者预后效果尚无定论。

He等直接从无标记病理样品的多光子显微病理图像出发，根据TILs与肿瘤细胞、胶原纤维的相对位置将TILs重新分为3种。基于这三种模式的出现频率，结合岭回归分析提出了一种评估TILs预后价值的新方法，即肿瘤浸润性淋巴细胞评分（TILs-score）。医学统计分析结果表明，TILs-score对ER阳性乳腺癌患者具有更强的预后价值。

深远意义与未来展望
在临床方面，分析肿瘤微环境中胶原纤维、肿瘤浸润淋巴细胞等组分，能精准预测患者预后，助力医生制定个性化方案，避免治疗不当，提升患者生存率与生活质量，比如对不同风险评分患者采取差异化治疗。在科研上，为乳腺癌基础研究提供新途径，有助于探究肿瘤微环境作用机制及细胞与组织关系，为开发新疗法提供理论依据。在未来，基于肿瘤微环境的乳腺癌预测模型是发展趋势。一方面要优化多光子显微成像技术，如研发先进设备、结合新型成像技术获取更多信息；另一方面要加强计算机辅助图像分析研究，利用人工智能等构建更精准的预后评估模型。此外，还需开展多中心大样本临床研究，推动该技术广泛应用，为乳腺癌患者带来希望。

论文信息
声明：本文仅用作学术目的。
徐顺武, 何佳佳, 席刚琴, 李连煌, 韩侠辉, 郑莉琴, 陈建新. 多光子显微技术在乳腺肿瘤微环境预后预测研究中的应用进展[J]. 激光与光电子学进展, 2022, 59(6): 0617013. 

DOI:10. 3788/LOP202259. 0617013.