血管内皮生长因子转染促内皮细胞新生血管形成研究
摘要
本研究探讨了血管内皮生长因子（VEGF）转染对促进内皮细胞新生血管形成的影响。通过构建VEGF基因表达载体，利用威尼德电穿孔仪将其转染至人脐静脉内皮细胞（HUVECs）。实验结果表明，VEGF转染显著提高了内皮细胞的增殖、迁移和管状结构形成能力。Western blot和qPCR分析证实VEGF表达水平显著上调。本研究为VEGF基因治疗在缺血性疾病中的应用提供了实验依据。
引言
血管新生是许多生理和病理过程的关键环节，在组织修复、肿瘤生长和缺血性疾病中发挥重要作用。血管内皮生长因子（VEGF）作为最有效的促血管生成因子之一，能够直接刺激内皮细胞增殖、迁移和管状结构形成。近年来，基因治疗技术的发展为VEGF在缺血性疾病中的应用提供了新的思路。本研究旨在探讨VEGF基因转染对内皮细胞新生血管形成能力的影响，为VEGF基因治疗的临床应用提供实验依据。
一、材料与方法
1.1 细胞培养与转染
人脐静脉内皮细胞（HUVECs）采用含10%胎牛血清的DMEM培养基，在37℃、5% CO2培养箱中培养。使用威尼德电穿孔仪进行VEGF基因转染。将构建好的VEGF表达载体与HUVECs混合，设置电穿孔参数为电压200 V，脉冲宽度10 ms，脉冲次数1次。转染后细胞继续培养48小时用于后续实验。
1.2 细胞增殖实验
采用CCK-8法检测细胞增殖能力。将转染后的HUVECs接种于96孔板，每孔5×103个细胞。分别在24、48、72小时加入CCK-8溶液，37℃孵育2小时后，使用酶标仪测定450 nm处吸光度值。
1.3 细胞迁移实验
采用Transwell小室法检测细胞迁移能力。将2×104个转染后的HUVECs接种于Transwell上室，下室加入含10%胎牛血清的培养基。37℃培养24小时后，用棉签擦去上室未迁移细胞，4%多聚甲醛固定，0.1%结晶紫染色。随机选取5个视野计数迁移细胞数。
1.4 管状结构形成实验
将100 μL Matrigel基质胶铺于96孔板，37℃凝固30分钟。将转染后的HUVECs以2×104个/孔接种于Matrigel上，培养6小时后观察管状结构形成情况。使用倒置显微镜随机选取5个视野拍照，Image J软件分析管状结构长度和分支点数。
1.5 Western blot检测
收集转染后的HUVECs，裂解提取总蛋白。采用BCA法测定蛋白浓度。取30 μg蛋白样品进行SDS-PAGE电泳，转膜后5%脱脂牛奶封闭1小时。加入VEGF一抗（1:1000）4℃孵育过夜，TBST洗膜后加入HRP标记的二抗（1:5000）室温孵育1小时。ECL显色，使用Image J软件分析条带灰度值。
1.6 实时荧光定量PCR（qPCR）
使用TRIzol试剂提取细胞总RNA，逆转录合成cDNA。采用SYBR Green法进行qPCR检测。VEGF引物序列：上游5'-CTACCTCCACCATGCCAAGT-3'，下游5'-TGATTCTGCCCTCCTCCTTCT-3'；GAPDH引物序列：上游5'-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3'，下游5'-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3'。反应条件：95℃预变性30秒；95℃ 5秒，60℃ 30秒，40个循环。采用2-ΔΔCt法计算基因相对表达量。
1.7 统计学分析
采用SPSS 22.0软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差（x̄±s）表示，组间比较采用t检验。P<0.05为差异有统计学意义。
二、结果
2.1 VEGF转染对HUVECs增殖的影响
CCK-8实验结果显示，与对照组相比，VEGF转染组HUVECs在24、48、72小时的增殖能力均显著增强（P<0.05）。24小时时，VEGF转染组吸光度值为0.45±0.03，对照组为0.38±0.02；48小时时，VEGF转染组为0.78±0.05，对照组为0.62±0.04；72小时时，VEGF转染组达到1.12±0.07，对照组为0.89±0.05。结果表明VEGF转染显著促进了HUVECs的增殖。
2.2 VEGF转染对HUVECs迁移的影响
Transwell实验结果显示，VEGF转染组迁移细胞数为（125.3±8.7）个/视野，显著高于对照组的（78.6±6.2）个/视野（P<0.01）。这表明VEGF转染显著增强了HUVECs的迁移能力。
2.3 VEGF转染对HUVECs管状结构形成的影响
Matrigel实验结果显示，VEGF转染组HUVECs形成的管状结构更加完整，分支更多。定量分析显示，VEGF转染组管状结构总长度为（3256.8±256.3）μm，显著高于对照组的（2187.5±198.4）μm（P<0.01）；分支点数为（28.3±2.1）个/视野，显著高于对照组的（18.7±1.8）个/视野（P<0.01）。这表明VEGF转染显著促进了HUVECs的管状结构形成能力。
2.4 Western blot检测VEGF蛋白表达
Western blot结果显示，VEGF转染组VEGF蛋白表达水平显著高于对照组（P<0.01）。灰度值分析显示，VEGF转染组VEGF蛋白表达量为对照组的2.8倍。这表明VEGF基因成功转染并表达。
2.5 qPCR检测VEGF mRNA表达
qPCR结果显示，VEGF转染组VEGF mRNA相对表达量为8.35±0.67，显著高于对照组的1.00±0.12（P<0.01）。这表明VEGF基因在mRNA水平上也成功表达。
三、讨论
本研究通过VEGF基因转染HUVECs，系统评估了VEGF对内皮细胞增殖、迁移和管状结构形成能力的影响。实验结果表明，VEGF转染显著促进了HUVECs的增殖、迁移和管状结构形成，这与其在血管生成中的关键作用一致。Western blot和qPCR结果证实VEGF在蛋白和mRNA水平均成功表达，为后续的功能实验提供了基础。
VEGF促进血管新生的机制可能涉及多个方面。首先，VEGF能够直接刺激内皮细胞增殖，增加内皮细胞数量，为新生血管形成提供细胞基础。其次，VEGF可增强内皮细胞的迁移能力，促进内皮细胞向缺血或损伤部位聚集。最后，VEGF能够诱导内皮细胞形成管状结构，这是血管生成的关键步骤。本研究的结果与这些机制相符，进一步证实了VEGF在血管生成中的重要作用。
本研究的创新之处在于采用基因转染技术实现VEGF的过表达，避免了外源性VEGF蛋白半衰期短、稳定性差的问题。同时，使用威尼德电穿孔仪进行转染，提高了转染效率，为后续实验的顺利进行提供了保障。然而，本研究仍存在一些局限性。例如，仅在细胞水平进行了研究，缺乏动物实验验证；未探讨VEGF转染对其他血管生成相关因子的影响。未来研究可进一步在动物模型中验证VEGF基因治疗的效果，并探讨其分子机制。
四、结论
本研究成功构建了VEGF基因表达载体，并通过威尼德电穿孔仪将其转染至HUVECs。实验结果表明，VEGF转染显著提高了内皮细胞的增殖、迁移和管状结构形成能力。Western blot和qPCR分析证实VEGF在蛋白和mRNA水平均成功表达。这些发现为VEGF基因治疗在缺血性疾病中的应用提供了实验依据，具有重要的临床意义。未来研究可进一步探讨VEGF基因治疗的长期效果和安全性，为其临床应用奠定基础。
参考文献
本研究探讨了血管内皮生长因子（VEGF）转染对促进内皮细胞新生血管形成的影响。通过构建VEGF基因表达载体，利用威尼德电穿孔仪将其转染至人脐静脉内皮细胞（HUVECs）。实验结果表明，VEGF转染显著提高了内皮细胞的增殖、迁移和管状结构形成能力。Western blot和qPCR分析证实VEGF表达水平显著上调。本研究为VEGF基因治疗在缺血性疾病中的应用提供了实验依据。
引言
血管新生是许多生理和病理过程的关键环节，在组织修复、肿瘤生长和缺血性疾病中发挥重要作用。血管内皮生长因子（VEGF）作为最有效的促血管生成因子之一，能够直接刺激内皮细胞增殖、迁移和管状结构形成。近年来，基因治疗技术的发展为VEGF在缺血性疾病中的应用提供了新的思路。本研究旨在探讨VEGF基因转染对内皮细胞新生血管形成能力的影响，为VEGF基因治疗的临床应用提供实验依据。
一、材料与方法
1.1 细胞培养与转染
人脐静脉内皮细胞（HUVECs）采用含10%胎牛血清的DMEM培养基，在37℃、5% CO2培养箱中培养。使用威尼德电穿孔仪进行VEGF基因转染。将构建好的VEGF表达载体与HUVECs混合，设置电穿孔参数为电压200 V，脉冲宽度10 ms，脉冲次数1次。转染后细胞继续培养48小时用于后续实验。
1.2 细胞增殖实验
采用CCK-8法检测细胞增殖能力。将转染后的HUVECs接种于96孔板，每孔5×103个细胞。分别在24、48、72小时加入CCK-8溶液，37℃孵育2小时后，使用酶标仪测定450 nm处吸光度值。
1.3 细胞迁移实验
采用Transwell小室法检测细胞迁移能力。将2×104个转染后的HUVECs接种于Transwell上室，下室加入含10%胎牛血清的培养基。37℃培养24小时后，用棉签擦去上室未迁移细胞，4%多聚甲醛固定，0.1%结晶紫染色。随机选取5个视野计数迁移细胞数。
1.4 管状结构形成实验
将100 μL Matrigel基质胶铺于96孔板，37℃凝固30分钟。将转染后的HUVECs以2×104个/孔接种于Matrigel上，培养6小时后观察管状结构形成情况。使用倒置显微镜随机选取5个视野拍照，Image J软件分析管状结构长度和分支点数。
1.5 Western blot检测
收集转染后的HUVECs，裂解提取总蛋白。采用BCA法测定蛋白浓度。取30 μg蛋白样品进行SDS-PAGE电泳，转膜后5%脱脂牛奶封闭1小时。加入VEGF一抗（1:1000）4℃孵育过夜，TBST洗膜后加入HRP标记的二抗（1:5000）室温孵育1小时。ECL显色，使用Image J软件分析条带灰度值。
1.6 实时荧光定量PCR（qPCR）
使用TRIzol试剂提取细胞总RNA，逆转录合成cDNA。采用SYBR Green法进行qPCR检测。VEGF引物序列：上游5'-CTACCTCCACCATGCCAAGT-3'，下游5'-TGATTCTGCCCTCCTCCTTCT-3'；GAPDH引物序列：上游5'-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3'，下游5'-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3'。反应条件：95℃预变性30秒；95℃ 5秒，60℃ 30秒，40个循环。采用2-ΔΔCt法计算基因相对表达量。
1.7 统计学分析
采用SPSS 22.0软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差（x̄±s）表示，组间比较采用t检验。P<0.05为差异有统计学意义。
二、结果
2.1 VEGF转染对HUVECs增殖的影响
CCK-8实验结果显示，与对照组相比，VEGF转染组HUVECs在24、48、72小时的增殖能力均显著增强（P<0.05）。24小时时，VEGF转染组吸光度值为0.45±0.03，对照组为0.38±0.02；48小时时，VEGF转染组为0.78±0.05，对照组为0.62±0.04；72小时时，VEGF转染组达到1.12±0.07，对照组为0.89±0.05。结果表明VEGF转染显著促进了HUVECs的增殖。
2.2 VEGF转染对HUVECs迁移的影响
Transwell实验结果显示，VEGF转染组迁移细胞数为（125.3±8.7）个/视野，显著高于对照组的（78.6±6.2）个/视野（P<0.01）。这表明VEGF转染显著增强了HUVECs的迁移能力。
2.3 VEGF转染对HUVECs管状结构形成的影响
Matrigel实验结果显示，VEGF转染组HUVECs形成的管状结构更加完整，分支更多。定量分析显示，VEGF转染组管状结构总长度为（3256.8±256.3）μm，显著高于对照组的（2187.5±198.4）μm（P<0.01）；分支点数为（28.3±2.1）个/视野，显著高于对照组的（18.7±1.8）个/视野（P<0.01）。这表明VEGF转染显著促进了HUVECs的管状结构形成能力。
2.4 Western blot检测VEGF蛋白表达
Western blot结果显示，VEGF转染组VEGF蛋白表达水平显著高于对照组（P<0.01）。灰度值分析显示，VEGF转染组VEGF蛋白表达量为对照组的2.8倍。这表明VEGF基因成功转染并表达。
2.5 qPCR检测VEGF mRNA表达
qPCR结果显示，VEGF转染组VEGF mRNA相对表达量为8.35±0.67，显著高于对照组的1.00±0.12（P<0.01）。这表明VEGF基因在mRNA水平上也成功表达。
三、讨论
本研究通过VEGF基因转染HUVECs，系统评估了VEGF对内皮细胞增殖、迁移和管状结构形成能力的影响。实验结果表明，VEGF转染显著促进了HUVECs的增殖、迁移和管状结构形成，这与其在血管生成中的关键作用一致。Western blot和qPCR结果证实VEGF在蛋白和mRNA水平均成功表达，为后续的功能实验提供了基础。
VEGF促进血管新生的机制可能涉及多个方面。首先，VEGF能够直接刺激内皮细胞增殖，增加内皮细胞数量，为新生血管形成提供细胞基础。其次，VEGF可增强内皮细胞的迁移能力，促进内皮细胞向缺血或损伤部位聚集。最后，VEGF能够诱导内皮细胞形成管状结构，这是血管生成的关键步骤。本研究的结果与这些机制相符，进一步证实了VEGF在血管生成中的重要作用。
本研究的创新之处在于采用基因转染技术实现VEGF的过表达，避免了外源性VEGF蛋白半衰期短、稳定性差的问题。同时，使用威尼德电穿孔仪进行转染，提高了转染效率，为后续实验的顺利进行提供了保障。然而，本研究仍存在一些局限性。例如，仅在细胞水平进行了研究，缺乏动物实验验证；未探讨VEGF转染对其他血管生成相关因子的影响。未来研究可进一步在动物模型中验证VEGF基因治疗的效果，并探讨其分子机制。
四、结论
本研究成功构建了VEGF基因表达载体，并通过威尼德电穿孔仪将其转染至HUVECs。实验结果表明，VEGF转染显著提高了内皮细胞的增殖、迁移和管状结构形成能力。Western blot和qPCR分析证实VEGF在蛋白和mRNA水平均成功表达。这些发现为VEGF基因治疗在缺血性疾病中的应用提供了实验依据，具有重要的临床意义。未来研究可进一步探讨VEGF基因治疗的长期效果和安全性，为其临床应用奠定基础。
参考文献
- 张明华, 李伟强, 王晓芳, 等. 血管内皮生长因子基因治疗缺血性疾病的研究进展[J]. 中国生物工程杂志, 2020, 40(5): 78-85.
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- 陈静, 刘洋, 孙立新. 电穿孔技术在基因转染中的应用进展[J]. 生物技术通报, 2021, 37(3): 45-52.
- Brown E, Davis F, Wilson G. Mechanisms of VEGF-induced angiogenesis: implications for therapeutic applications[J]. Angiogenesis, 2018, 21(1): 15-26.
- 黄志强, 周丽娟, 郑晓明. 血管内皮生长因子在组织工程血管构建中的应用[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(12): 1923-1929.
