线性多核苷酸借电穿孔增强真核细胞转染

摘要：

本文研究了通过电穿孔法使用线性多核苷酸增强真核细胞转染的效率和效果。实验采用威尼德电穿孔仪，利用优化后的电穿孔参数，成功在人类造血细胞，特别是树突细胞（DC）中实现高效基因递送。该方法优于传统脂质体转染和质粒cDNA电穿孔，为基因治疗、疫苗开发和免疫治疗提供了有力工具。

引言：

基因递送是基因治疗、疫苗开发和免疫治疗中的关键环节。传统方法如脂质体转染和质粒cDNA电穿孔虽已广泛应用，但存在转染效率低、细胞毒性大等问题。线性多核苷酸作为基因递送的载体，具有稳定性高、易于合成和修饰等优点。然而，如何高效地将线性多核苷酸递送到真核细胞中，仍是当前研究的热点和难点。

电穿孔法作为一种物理转染方法，通过施加短暂的高压电脉冲，在细胞膜上形成瞬时微孔，使带电荷的分子如DNA、RNA等能够进入细胞内。与其他转染方法相比，电穿孔法具有操作简便、适用范围广、转染效率高等优点。本研究旨在通过优化电穿孔参数，使用线性多核苷酸作为载体，增强真核细胞的转染效率和效果，为基因治疗、疫苗开发和免疫治疗提供新的策略和方法。

材料与方法：

1. 实验材料：

   • 细胞：人类外周血单核细胞（PBMC）、单核细胞衍生的树突细胞（Mo-DC）。
   • 线性多核苷酸：增强型绿色荧光蛋白（EGFP）mRNA。
   • 试剂：某试剂IMDM培养基、Opti-MEM培养基、Optimix培养基、电穿孔缓冲液、成熟刺激剂（IL-1β、IL-6、TNF-α、PGE2等）。
   • 仪器：威尼德电穿孔仪、流式细胞仪（FACS）。

2. 实验方法：

   • 细胞培养与分化：从新鲜血液中分离PBMC，用IMDM培养基洗涤后，用电穿孔洗涤缓冲液洗涤，并以一定密度重新悬浮在Opti-MEM或Optimix培养基中。对于Mo-DC的分化，将PBMC在补充了GM-CSF和IL-4的培养基中培养6-7天。
   • 电穿孔转染：在电穿孔前，将EGFP mRNA添加到细胞中，混合均匀后，将细胞悬浮液转移到威尼德电穿孔仪的样品池中。设置合适的电穿孔参数（如电压、脉冲时间、电容等），触发电穿孔。
   • 细胞成熟与检测：对于Mo-DC，在电穿孔后，通过添加成熟刺激剂诱导其成熟。在转染后不同时间点，使用流式细胞仪检测EGFP的表达水平和细胞存活率。

实验结果：

1. 转染效率：

   实验结果表明，通过优化电穿孔参数，本研究成功在人类造血细胞，特别是Mo-DC中实现了高效基因递送。在不成熟的Mo-DC中，使用400V的电压和500μs的脉冲时间，转染效率可达4%以上。进一步提高电压至600V，转染效率有所增强，但细胞存活率略有下降。

2. 细胞存活率：

   电穿孔后，细胞存活率受到一定影响。然而，通过优化电穿孔参数和细胞培养条件，本研究成功地将细胞死亡率控制在较低水平。在电穿孔后96小时，即使使用600V的电压，死亡细胞数量也仅为大约16%。

3. 基因表达与细胞成熟：

   在转染后不同时间点，通过流式细胞仪检测EGFP的表达水平。结果表明，EGFP在Mo-DC中成功表达，且表达水平随时间逐渐增加。同时，通过添加成熟刺激剂，成功诱导了Mo-DC的成熟。成熟后的Mo-DC具有更强的转基因表达能力和更低的细胞死亡率。

4. 冷冻保存与复苏：

   实验还探索了转染后的Mo-DC的冷冻保存与复苏效果。结果表明，在电穿孔后18小时冷冻的不成熟的Mo-DC在解冻后能够很好地存活并表达EGFP。然而，在解冻后24小时，与在电穿孔后已培养了48小时的未冷冻对照相比，冷冻培养物具有高水平的细胞死亡率。相比之下，成熟的Mo-DC比冷冻的不成熟Mo-DC更好地从解冻过程中存活下来。

讨论：

1. 电穿孔参数优化：

   电穿孔参数是影响转染效率和细胞存活率的关键因素。本研究通过优化电压、脉冲时间、电容等参数，成功在人类造血细胞中实现了高效基因递送。结果表明，适当的电压和脉冲时间可以显著提高转染效率，但过高的电压会导致细胞死亡率增加。因此，在实际应用中需要根据细胞类型和实验需求选择合适的电穿孔参数。

2. 细胞类型与分化状态：

   不同细胞类型和分化状态对电穿孔转染的效率和效果具有显著影响。本研究发现，在人类造血细胞中，Mo-DC具有较高的转染效率和较低的细胞死亡率。此外，不成熟的Mo-DC在转染后更容易诱导成熟，而成熟的Mo-DC则具有更强的转基因表达能力和更低的细胞死亡率。这些结果为后续研究和应用提供了重要参考。

3. 基因治疗与免疫治疗：

   本研究为基因治疗、疫苗开发和免疫治疗提供了新的策略和方法。通过电穿孔法将线性多核苷酸递送到真核细胞中，可以实现高效基因表达和功能调控。这对于治疗遗传性疾病、感染性疾病和癌症等具有重要意义。同时，该方法还可以用于制备基于DC的肿瘤疫苗和免疫治疗试剂，为癌症治疗提供新的途径和手段。

4. 创新与应用前景：

   本研究在电穿孔转染技术方面取得了重要创新。通过优化电穿孔参数和使用线性多核苷酸作为载体，成功实现了高效基因递送和细胞功能调控。该技术具有操作简便、适用范围广、转染效率高等优点，在基因治疗、疫苗开发和免疫治疗等领域具有广阔的应用前景。