多种小鼠模型在建立体内细胞衰老的谱系示踪及功能研究技术中的应用
本文转载于：中国科学院分子细胞卓越中心
2024年10月4日，中国科学院分子细胞科学卓越创新中心周斌研究员在Cell学术期刊在线发表题为Identifying specific functional roles for senescence across cell types的论文。
南模生物为该研究提供了多种小鼠模型：
p16-tdT, p16-CreER, p16-LSL-Dre, Cd68-Cre, R26-RL-tdT-DTR, p16-CreXER, H11-Kdr-mCherry。
该研究基于双同源重组酶系统建立了体内细胞衰老的谱系示踪及功能研究技术，系统探讨了肝脏损伤和修复过程中不同细胞类型衰老细胞的命运轨迹及其特定作用。这一研究工作不仅为肝脏疾病的临床治疗提供新的研究方向和理论依据，也为衰老领域和再生医学研究提供了新的技术路径与方法。
目前对衰老细胞功能的研究普遍缺乏针对性，通常不加区分地针对所有类型的衰老细胞，忽略了细胞类型的特异性。这使得我们对特定细胞类型衰老细胞的命运轨迹和他们对生理病理的作用知之甚少。为解决这一科学问题，周斌组建立了体内细胞衰老的谱系示踪及功能研究技术，揭示了体内细胞衰老的命运轨迹和特定功能。
研究团队首先构建了一种荧光报告基因小鼠品系p16-tdT，通过检测不同年龄段各器官中tdT的表达，发现tdT+细胞在不同器官中的类型具有多样性且比例随着年龄的增长显著增加。同时，这些tdT+细胞表现出明显的SA-β-Gal活性、更低的增殖能力及高表达SASP因子等，进一步验证了p16Ink4a+细胞的细胞衰老表型。
图1. 衰老的p16-tdT小鼠多种细胞类型表达tdT
细胞衰老与肝纤维化有相关性，针对肝纤维化这一特定病理过程，研究团队利用四氯化碳（CCl4）诱导的肝脏损伤模型，结合免疫染色和scRNA测序技术，发现肝损伤中p16Ink4a+细胞主要为内皮细胞和巨噬细胞。对其进行基因表达谱分析，结果表明这些p16Ink4a+巨噬细胞和内皮细胞表现出独特的基因表达变化，包括SASP因子的表达和细胞衰老相关信号通路上调等。
为进一步研究细胞类型特异性p16Ink4a+细胞在肝损伤和修复中的命运，研究团队开发了一种名为Sn-pTracer（senescent cells-pulse-chase-tracer）的遗传系统。该系统利用双重组酶技术，只在共表达Dre和Cre重组酶的细胞中，R26-RL-tdT（Rosa26-rox-Stop-rox-loxP-Stop-loxP-tdT）报告小鼠的两个Stop序列才会被移除，从而诱导tdT的表达。
图2. Sn-pTracer的标记策略图
研究团队将巨噬细胞特异性F4/80-Dre或内皮细胞特异性Cdh5-DreER小鼠品系与p16-CreER和R26-RL-tdT小鼠交配，得到了F4/80-Dre; p16-CreER; R26-RL-tdT小鼠（SnMø-pTracer）及Cdh5-DreER; p16-CreER; R26-RL-tdT小鼠（SnEC-pTracer）。在CCl4诱导的肝损伤中，SnMø-pTracer和SnEC-pTracer系统分别精确标记了p16Ink4a+巨噬细胞和p16Ink4a+内皮细胞。
结果发现，肝损伤的p16Ink4a+巨噬细胞显著增多但修复后大量凋亡，被p16Ink4a-巨噬细胞替代。
图3. SnMø-pTracer小鼠结果图
相反，p16Ink4a+内皮细胞在损伤后虽也增加，但在肝脏修复阶段大部分存活，表明对内皮细胞而言，其衰老状态可能是可逆的细胞周期停滞。
图4. SnEC-pTracer小鼠结果图
这些发现揭示了不同类型细胞在应对肝损伤时不同的衰老与修复机制，为深入理解细胞命运调控及组织修复策略提供了新视角。
使用Sn-pTracer系统需要具有细胞类型特异性的Dre工具小鼠，相对Cre工具鼠的数量较少。此外，tamoxifen（Tam）在体内的血清半衰期较短，在损伤期间对Sn-pTracer小鼠持续使用Tam诱导以记录细胞衰老不仅是一种负担，而且可能对小鼠健康有害。
为克服这些限制，研究团队开发了一种新的遗传系统，命名为Sn-cTracer（senescent cells-Cre-induced-tracer）。Sn-cTracer 涉及三种小鼠品系：细胞类型特异性Cre（ER）工具小鼠、p16-LSL-Dre（p16-loxP-Stop-loxP-Dre）和R26-RL-tdT-DTR（Rosa26-rox-Stop-roxP-Stop-loxP-tdT-DTR）。Cre-loxP重组可切除p16-LSL-Dre的Stop序列，从而在Cre表达细胞中将p16-LSL-Dre转化为p16-Dre，并且只有同时表达Dre和Cre的细胞才能移除R26-RL-tdT-DTR等位基因中的两个Stop序列，从而永久表达tdT和DTR（白喉毒素受体），实现以细胞类型特异性的方式对p16Ink4a+细胞进行不间断记录和遗传清除。
图5. SnEC-cTracer的标记策略图
图6. DT处理进行p16Ink4a+巨噬细胞的遗传消融，显著改善损伤后的肝纤维化
那p16Ink4a+内皮细胞有什么作用呢？研究人员构建了SnEC-cTracer小鼠。与p16Ink4a+巨噬细胞相反，特异性清除p16Ink4a+内皮细胞后肝脏纤维化程度加剧，表明这些细胞在限制肝损伤和纤维化过程中发挥重要作用。
图7. DT处理进行p16Ink4a+内皮细胞的遗传消融，在肝损伤期间加剧了肝纤维化
p16Ink4a+巨噬细胞和内皮细胞在肝纤维化中的不同作用机制为何？研究人员采用scRNA-seq技术对SnMø-cTracer和SnEC-cTracer小鼠的肝脏非实质细胞进行了深入分析。在SnMø-cTracer小鼠中，DT处理显著改变了巨噬细胞群体的基因表达谱，上调了与免疫激活相关的通路，如促进自然杀伤细胞（NK细胞）和T淋巴细胞增殖，这提示清除p16Ink4a+巨噬细胞限制肝纤维化可能是通过改变了肝脏免疫微环境导致的。内皮细胞群体的基因表达变化表明清除p16Ink4a+内皮细胞后，肝组织向促纤维化环境转变，成纤维细胞和间充质细胞增殖增强，提示p16Ink4a+内皮细胞抑制成纤维细胞增殖的重要作用。这些发现不仅揭示了两种细胞类型在肝纤维化中的不同作用机制，也为开发针对肝纤维化的精准治疗策略提供了新的见解。
研究团队还利用SnEC-gTracer系统实现了在p16Ink4a+内皮细胞中过表达Kdr。在肝纤维化模型中，SnEC-gTracer小鼠肝脏中具有较多mCherry+内皮细胞，并伴随EdU结合阳性，具有一定的细胞增殖能力，同时SASP因子表达减弱。更重要的是，纤维化标记物免疫荧光染色及天狼星红染色结果均显示，Kdr过表达显著减轻了肝纤维化程度。这一发现不仅揭示了p16Ink4a+内皮细胞在肝纤维化中的新角色，还展示了通过遗传重编程改善肝脏损伤的巨大潜力，为肝纤维化治疗提供了新的策略与希望。
图8. 文章模式图
综上，细胞类型特异性p16Ink4a+细胞的精准遗传靶向是揭示其在衰老与疾病中功能的关键，该研究建立了体内细胞衰老的谱系示踪及功能研究技术，开发了四种互补的遗传策略，研究不同细胞类型中p16Ink4a+衰老细胞的体内命运与特定功能，不仅为细胞衰老与损伤再生的研究提供了新的视角和工具，也为未来精准靶向细胞衰老疗法奠定了坚实的理论基础。
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