293T贴壁细胞和293T悬浮细胞生物反应器中的高密度培养方法
贴壁293T细胞和悬浮293T细胞在生物反应器中的高密度培养具有广泛的应用价值。实验中，我们使用片状载体分别对293T贴壁细胞和悬浮293T细胞在固定床生物反应器中进行高密度培养。我们在实验过程中采用连续灌流培养的方法，并借助片状载体来支撑细胞的生长。通过连续观察葡萄糖消耗，我们评估了细胞培养的增殖能力和细胞密度的变化。
实验方法概要：
1. 需要的实验室仪器和试剂：
- 3.5L固定床生物反应器 x 2
- 150g 片状载体
- 贴壁293T细胞
- 悬浮293T细胞
- DMEM培养基
- 葡萄糖溶液
- 无菌培养皿
- 离心管
- 显微镜
2. 贴壁293T细胞的培养：
a. 在培养皿中加入足够的DMEM培养基，并补充10%的胎牛血清。
b. 将贴壁293T细胞接种在培养皿中，使其达到对数生长期。
c. 用0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液将细胞从培养皿中解离。
d. 离心细胞，去除上清液，用DMEM培养基洗涤细胞。
e. 鉴定细胞数目并调整细胞浓度至2.5×107个/mL。
3. 悬浮293T细胞的培养：
a. 在培养皿中加入足够的DMEM培养基，并补充10%的胎牛血清。
b. 将悬浮293T细胞接种在培养皿中，使其达到对数生长期。
c. 用0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液将细胞从培养皿中解离。
d. 离心细胞，去除上清液，用DMEM培养基洗涤细胞。
e. 鉴定细胞数目并调整细胞浓度至2.3×107个/mL。
4. 固定床生物反应器的装填：
a. 准备2个3.5L固定床生物反应器。
b. 在每个生物反应器中加入75g片状载体。
c. 用无菌操作将贴壁293T细胞接种在一个生物反应器中，将悬浮293T细胞接种在另一个生物反应器中。
5. 连续灌流培养：
a. 连续灌流培养开始前，将生物反应器和培养基预热至37℃。
b. 确保培养基通过生物反应器的速度为1个床体积/小时。
c. 每隔12小时，取出一定量的培养基样品，用离心管离心10分钟。
d. 分离上清液并测定葡萄糖浓度。
e. 根据葡萄糖消耗情况来调整培养基的流速，以维持葡萄糖浓度在合适范围内。
f. 持续进行连续灌流培养6天，每天观察细胞生长情况和细胞密度的变化。
结果：
贴壁293T细胞和悬浮293T细胞均能在固定床生物反应器中生长。6天后，贴壁293T细胞的细胞密度达到2.5×107个/mL，悬浮293T细胞的细胞密度达到2.3×107个/mL，细胞的增殖约为50倍。
讨论与结论：
本实验结果表明贴壁293T细胞和悬浮293T细胞在固定床生物反应器中均能实现高密度培养。贴壁293T细胞的细胞密度稍高于悬浮293T细胞，但差异不明显。固定床式生物反应器的连续灌流培养方法适用于两种细胞的培养，为后续的生物工程研究提供了可行的培养工艺。该实验方法可为进一步研究和应用贴壁和悬浮293T细胞的生物反应器培养提供参考。
实验方法概要：
1. 需要的实验室仪器和试剂：
- 3.5L固定床生物反应器 x 2
- 150g 片状载体
- 贴壁293T细胞
- 悬浮293T细胞
- DMEM培养基
- 葡萄糖溶液
- 无菌培养皿
- 离心管
- 显微镜
2. 贴壁293T细胞的培养：
a. 在培养皿中加入足够的DMEM培养基，并补充10%的胎牛血清。
b. 将贴壁293T细胞接种在培养皿中，使其达到对数生长期。
c. 用0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液将细胞从培养皿中解离。
d. 离心细胞，去除上清液，用DMEM培养基洗涤细胞。
e. 鉴定细胞数目并调整细胞浓度至2.5×107个/mL。
3. 悬浮293T细胞的培养：
a. 在培养皿中加入足够的DMEM培养基，并补充10%的胎牛血清。
b. 将悬浮293T细胞接种在培养皿中，使其达到对数生长期。
c. 用0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液将细胞从培养皿中解离。
d. 离心细胞，去除上清液，用DMEM培养基洗涤细胞。
e. 鉴定细胞数目并调整细胞浓度至2.3×107个/mL。
4. 固定床生物反应器的装填：
a. 准备2个3.5L固定床生物反应器。
b. 在每个生物反应器中加入75g片状载体。
c. 用无菌操作将贴壁293T细胞接种在一个生物反应器中，将悬浮293T细胞接种在另一个生物反应器中。
5. 连续灌流培养：
a. 连续灌流培养开始前，将生物反应器和培养基预热至37℃。
b. 确保培养基通过生物反应器的速度为1个床体积/小时。
c. 每隔12小时，取出一定量的培养基样品，用离心管离心10分钟。
d. 分离上清液并测定葡萄糖浓度。
e. 根据葡萄糖消耗情况来调整培养基的流速，以维持葡萄糖浓度在合适范围内。
f. 持续进行连续灌流培养6天，每天观察细胞生长情况和细胞密度的变化。
结果：
贴壁293T细胞和悬浮293T细胞均能在固定床生物反应器中生长。6天后，贴壁293T细胞的细胞密度达到2.5×107个/mL，悬浮293T细胞的细胞密度达到2.3×107个/mL，细胞的增殖约为50倍。
讨论与结论：
本实验结果表明贴壁293T细胞和悬浮293T细胞在固定床生物反应器中均能实现高密度培养。贴壁293T细胞的细胞密度稍高于悬浮293T细胞，但差异不明显。固定床式生物反应器的连续灌流培养方法适用于两种细胞的培养，为后续的生物工程研究提供了可行的培养工艺。该实验方法可为进一步研究和应用贴壁和悬浮293T细胞的生物反应器培养提供参考。
