QCM生物传感器助力评估悬浮细胞表面糖基化情况研究
导读：描述了一种基于凝集素的悬浮细胞生物传感器，可利用QCM技术无标记检测肿瘤细胞表面糖基与蛋白相互作用的结合动力学。与传统的生物传感器相比，这种细胞生物传感器能够实时、无标记地原位检测悬浮肿瘤细胞表面的糖基化情况，获得更加接近于生物环境下的相互作用信息。
借用白同学的短视频话语：“今天是三甲子，三甲子带来新的生命起始”。作为生命科学仪器的供应商，三十年时间内看到了很多方法学带来的商业起伏，QCM是属于不温不火的一类方法学，原因可能是应用领域的研究开发以及推广使用的不足，我们希望将三甲子的运气带给QCM。我们在2023年末选择了十年前的这篇文献，作为2024年的开篇，致敬裴志超教授团队！也感谢第一作者李学明博士对本文做了认真的修改和校正！
2013年裴志超团队发表在《Chemical Communications》中题为“A suspension-cell biosensor for real-time determination of binding kinetics of protein-carbohydrate interactions on cancer cell surfaces”的研究论文，首次提出了一种悬浮细胞QCM生物传感器，并将其应用于评估悬浮细胞表面糖基化情况及其与蛋白的结合动力学研究。
研究背景
细胞表面的大多数膜蛋白都是糖基化的，其上附着各种糖链。研究发现，细胞表面的糖链在细胞识别、细胞通讯等许多生物学过程中起着至关重要的作用。许多疾病的发生和发展与细胞表面糖基化的改变密切相关。目前，有许多糖基化蛋白（糖蛋白）已被确定为多种疾病的生物标志物，如淋巴癌和乳腺癌等。糖类结合蛋白（凝集素）可用于检测肿瘤细胞表面糖基化模式的变化，对研究肿瘤的生长和转移具有非常重要的作用。
为了研究这些相互作用，需要有效的方法对细胞表面的糖基进行快速可靠的识别测试。目前，已有多种方法被报道用于分析糖-蛋白质相互作用，例如，酶联凝集素测定（ELLAs）、X射线晶体学、质谱（MS）、核磁共振（NMR）、微阵列技术和生物传感器等。其中，基于石英晶体微天平（QCM）和表面等离子体共振（SPR）的生物传感器技术越来越受欢迎，具有操作简单高效、无需标记、实时检测、灵敏度高等特点，并能够获得丰富的分子相互作用信息。
传统的生物传感器检测方法都局限于需要对糖蛋白等目标物进行分离纯化，然后把纯化的目标分子固定在芯片的表面进行检测。这不仅耗时费力，更重要的是完全改变了生物分子原有的生物环境。与其在细胞表面或生物环境下相比，这些方法把目标物与其生物环境彻底简单化了，无法提供完整的真实的生物环境下的相互作用信息。近年发展起来的细胞芯片技术能够在不破坏细胞形态结构的情况下实现在细胞表面进行原位检测分子相互作用，从而获得细胞环境下生物分子相互作用信息。
基于QCM技术的细胞生物芯片能够将细胞固定到芯片表面，进而能够在更加接近于生物环境下对细胞膜表面的分子相互作用进行实时检测，并能够获得相互作用的亲和力、动力学等丰富的相互作用信息，是研究细胞表面分子相互作用的一种新技术手段。目前，在细胞芯片上固定细胞的方法主要是依赖于贴壁细胞贴壁生长的特性使细胞粘附到多聚赖氨酸或聚苯乙烯包被的芯片表面，且细胞经常需要用甲醛固定以防止细胞脱落。与贴壁细胞相比，悬浮细胞由于其悬浮生长的特性很难使其粘附到芯片表面。因此，需要开发一种悬浮细胞生物芯片用于实时、无标记地检测悬浮细胞细胞表面的分子相互作用。
研究内容及结果
1. QCM悬浮细胞芯片的制备
研究人员首先将LNB-羧基芯片插入Attana细胞生物传感器中。芯片表面的羧基经EDC-sulfo-NHS活化，然后通过氨基偶联的方法将凝集素Con A共价结合到芯片表面，芯片上未反应完全的活化羧基用乙醇胺封闭（图1中的步骤i、ii）。然后，通过凝集素Con A与细胞表面糖基的相互作用将悬浮细胞（人急性髓细胞白血病细胞K562和人急性淋巴细胞白血病细胞Jurkat）捕获到芯片表面（图1中的步骤iii）制得QCM悬浮细胞芯片。将不同种类或浓度的凝集素溶液进样到QCM悬浮细胞芯片表面，凝集素与细胞表面糖基的相互作用（结合或解理）通过QCM生物传感器实时检测，获得丰富的相互作用信息（图1中的步骤iv）。
为了评估悬浮细胞在芯片表面的捕获情况，可以使用Hoechst染料对细胞核进行染色，在荧光显微镜下进行观察。如图2所示，悬浮细胞已被成功地捕获到了芯片上，且细胞分布均匀。
图2 荧光显微镜下观察芯片表面的细胞捕获情况
2. 细胞表面糖基化情况研究
凝集素作为一种能够高度特异性识别并结合特定结构糖基的蛋白，已成为研究肿瘤细胞表面糖基化的一个重要工具。如麦胚凝集素（WGA）、伴刀豆球蛋白A（Con A）、大豆凝集素（SBA）、荆豆凝集素I（UEA-I）和花生凝集素（PNA）能够分别特异性识别并结合细胞表面的N-乙酰基葡糖胺、甘露糖/葡萄糖、N-乙酰基半乳糖胺、L-岩藻糖和半乳糖残基。通过检测肿瘤细胞与这一系列凝集素的相互作用可以对肿瘤细胞表面的糖基化情况进行评估。
研究人员分别将两种不同类型的悬浮细胞（人急性髓细胞白血病细胞K562和人急性淋巴细胞白血病细胞Jurkat）捕获到芯片表面，制得QCM悬浮细胞芯片，并对这两种细胞表面的糖基化情况进行了研究。如图3所示，WGA对Jurkat细胞具有较高的响应值（123 Hz）说明Jurkat细胞表面具有高表达量的N-乙酰基葡糖胺，而K562细胞表面具有较低水平的N-乙酰基葡糖胺（48 Hz）。Con A和SBA对Jurkat细胞的响应值分别为：29 Hz和15 Hz，对K562细胞的响应值分别为24 Hz和10 Hz，两者相差不大，说明两种细胞表面葡萄糖/甘露糖和N-乙酰基半乳糖胺表达量较接近。UEA-I对K562细胞的响应值为12 Hz，而对Jurkat细胞的响应值只有2.8 Hz，说明K562细胞表面较Jurkat细胞表面具有较高水平的L-岩藻糖表达。PNA对两种细胞的响应值均很弱说明两种细胞表面的只有微量的半乳糖表达。由此可见，不同的凝集素对不同的细胞的响应值差异表明了细胞表面的糖基化差异情况。
3. 分子与细胞相互作用动力学研究
基于QCM技术的细胞生物芯片能够直接在细胞表面检测分子与细胞的相互作用，并能够获得相互作用的动力学数据。
如图4所示，研究人员通过检测一系列浓度的凝集素SBA与K562细胞的相互作用（检测凝集素与细胞的结合过程105 s、解离过程295 s）。结合－解离曲线用Attana分析软件进行拟合分析，获得SBA与K562细胞相互作用的动力学数据：结合速率常数kon = 7.56 × 104 M-1 s-1、解离速率常数koff = 3.89 × 10-4 s-1，以及亲和常数KD = 5.15 nM。（图中黑色曲线为实际所测SBA与K562细胞相互作用曲线，红色曲线为软件拟合曲线）
图4 SBA与K562细胞相互作用的动力学研究
结 论
研究人员提出了一种新颖的基于QCM技术的无标记悬浮细胞生物芯片，用于实时检测凝集素与细胞表面糖基的相互作用。将凝集素Con A共价修饰到QCM芯片表面，通过悬浮细胞表面的糖链与芯片表面Con A的特异性相互作用将悬浮细胞固定到芯片表面，制备QCM悬浮细胞生物芯片，并对这两种悬浮肿瘤细胞表面糖基化情况及其与凝集素相互作用的动力学进行了研究。该研究所制备的悬浮细胞生物芯片可实时、无标记检测悬浮细胞表面的生物分子与蛋白的相互作用，并进行相互作用的动力学研究，为研究悬浮细胞表面的糖基化情况提供了一种方便简洁、快速高效的新方法，为深刻理解和研究细胞表面的分子识别过程提供了一种新研究手段。
参考资料：
https://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2013/CC/c3cc45006f
Attana分子与细胞相互作用检测仪是基于石英晶体微天平（QCM）技术原理，可实时、无标记的检测分子相互作用的系统。目前已在动力学反应、抗原抗体反应、竞争力分析、有效浓度检测、抗原表位定位、粗样筛选、候选药物的筛查等领域广泛应用。
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