纳米抗体发现的酵母展示平台原理及应用
1.什么是酵母展示平台
酵母展示（或酵母表面展示）是一种强大的蛋白质工程技术，它是用整合到酵母细胞壁中的重组蛋白的表达来分离和工程化抗体。自 2000 年首次发表以来，酵母表面展示已被广泛用于设计各种蛋白质以提高亲和力、特异性、表达、稳定性和催化活性。
2.酵母展示原理
酵母抗体展示技术（Yeast Display Technology）是指用抗体序列可变区与凝集素Aga2p融合表达，Aga2p蛋白亚基通过两个二硫键与固定在酵母细胞壁上的Aga1p 蛋白亚基结合，结合流式分选技术，将靶向抗原的特异性抗体给筛选出来。
图1：酵母文库展示示意图
3.纳米抗体
纳米抗体（Nanobody, Nbs）是驼科动物外周血清产生的一种单链抗体，这些抗体仅由重链组成，缺乏轻链和功能性CH1和CH4结构域。VHH晶体为2.5nm，长4nm，分子量只有15KDa。相较于传统抗体，纳米抗体因其分子量小，从而更容易可穿透血脑屏障；原核或真核系统有高表达量；特异性强，亲和力高；对人的免疫原性弱等优点，因此在抗肿瘤药物研发、心脑血管疾病、免疫疾病等领域有巨大价值。
图2：纳米抗体的3D结构
4.纳米抗体酵母展示优缺点
4.1优点
（1）酵母作为真核表达系统，可以进行翻译后修饰来表达和折叠复杂的真核蛋白；
（2)）相对噬菌体展示文库技术而言，酵母展示技术在微量抗体表达后抗体活性要高，得益此基础，在流式筛选时就能区分抗体的亲和力高低；
（3）插入异源蛋白不会破坏表面蛋白的结构，也不会影响表面展示的效率。
4.2缺点
（1）相比于噬菌体展示技术，酵母展示库容量较低，因此主要应用于客户对项目库容要求不高，动物免疫后PBMC细胞经过二次分选以及避免漏掉二硫键形成的抗体发现项目；
（2）由于酵母表面存在多个蛋白质拷贝，可能会发生与寡聚蛋白靶标不希望的多价结合。
5.酵母抗体展示应用
随着这项技术的不断完善，现在酵母展示的应用包括酶工程；蛋白质表位作图、蛋白质-蛋白质相互作用的鉴定、免疫生物催化和生物传感器，以及用于生物技术和生物医学应用的酵母细胞上蛋白质和酶的展示。
6.泰克生物酵母抗体技术服务展示
纳米抗体酵母展示服务主要流程如下：抗原准备，羊驼免疫，PBMC分离，RNA提取，cDNA制备，文库构建，文库筛选，抗体表达。
图3：酵母抗体展示文库流程图
5.1抗原制备
5.1.1密码子优化+基因模板合成+表达载体构建；
5.1.2质粒抽提+转染（哺乳表达系统）目的蛋白检测（WB，SDS-PAGE）；
5.1.3蛋白表达放大+蛋白亲和纯化。
5.2动物免疫
5.2.1动物免疫4次，加强免疫一针，共计免疫5针；
5.2.2免疫前采集阴性血清，第4针采血进行ELISA检测血清效价；
5.2.3若第4针血清抗体效价（蛋白抗原>105；多肽抗原>104）满足要求，则采血前7天再次加强免疫1针，如不满足要求，则继续常规免疫；
5.2.4效价合格，采血（＞100ml）分离单核细胞。
5.3 cDNA制备
5.3.1 PBMC总RNA提取（参照RNA提取试剂盒）；
5.3.2高保真RT-PCR制备cDNA（参照反转录试剂盒）。
5.4文库制备
5.4.1以cDNA为模板，两轮PCR扩增VHH基因；
5.4.2酵母表达质粒构建与转化： VHH基因拼接酵母展示载体，电击转化酵母宿主菌，构建抗体库，电击次数不低于10次；
5.4.3鉴定：随机挑选24个克隆，PCR鉴定阳性率+PCR鉴定多样性+插入率。
图4：VHH阳性率:>90%
5.5文库筛选
5.5.1磁珠分选；
5.5.2 FACS分选（免疫双标分选）；
5.5.3铺板+阳性克隆菌培养+抗体基因测序；（>20个，多达96个）。
5.6抗体表达
5.6.1将获得的抗体序列构建合适的表达载体（哺乳表达）进行表达+亲和纯化+抗体蛋白定量；
图5：Fc-VHH纳米抗体表达结果图片
5.6.2 Elisa验证抗体与抗原结合，进行下游验证（交付EC50数据）;
5.6.3 BLI法验证抗体亲和力；
5.6.4细胞功能验证：流式验证；
5.6.5验证细胞系（抗原受体过表达细胞系）。
7.酵母展示服务优势
（1）物种适应性广泛：人，鼠，兔，羊，羊驼，骆驼，鱼等物种的单抗开发均兼容
（2）技术平台成熟：提供的1级免疫文库的建库库容为106-107；插入率均满足>95%，筛选获得的抗体亲和力普遍处于nM-pM级别
（3）开发周期短：获得PBMC后，建库到筛选获得抗体序列，3-4周
（4）产品交付标准高：针对免疫库，交付免疫前后血清，抗体展示文库，酵母表达菌株，抗体序列
随着抗体库技术的不断发展，噬菌体展示抗体文库已经生产了大量的高活性抗体，噬菌体展示技术的广泛应用促使科学家对于酵母文库技术的不断探索。酵母展示技术作为真核表达系统，相比于噬菌体展示系统有其独特的优势，因此在人类治疗和诊断领域也占据着重要地位。
