PCR反应扩增产物问题解析
PCR产物是否为特异性扩增 ，其结果是否准确可靠，必须对其进行严格的分析与鉴定，才能得出正确的结论。PCR产物的分析，可依据研究对象和目的不同而采用不同的分析方法。下面就扩增产物出现的状况分析：
1、扩增产物在凝胶中涂布或成片状条带弥散
（1）酶量过高。减少酶量；酶的质量差，调换另一来源的酶。
（2）dNTP浓度过高。减少dNTP的浓度。
（3）MgCl2浓度过高。可适当降低其用量。
（4）模板量过多。质粒DNA的用量应<50ng，而基因组DNA则应<200ng。
（5）引物浓度不够优化。对引物进行梯度稀释重复PCR反应。
（6）循环次数过多；增加模板量减少循环次数至30，缩短退火时间及延伸时间，或改用二种温度的PCR循环。
（7）退火温度过低。
（8）电泳体系有问题：
①凝胶中缓冲液和电泳缓冲液浓度相差太大；
②凝胶没有凝固好；
③琼脂糖质量差。
（9）若为PCR试剂盒则可能：
①由于运输储存不当引起试剂盒失效；
②试剂盒本身质量有问题，如引物选择、循环参数等选择不当。
（10）降解的陈旧模板扩增也易产生涂布。
2、. 扩增产物出现多条带（杂带）
（1）引物用量偏大，引物的特异性不高。应调换引物或降低引物的使用量。
（2）循环的次数过多。适当增加模板的量，减少循环次数。
（3）酶的用量偏高或酶的质量不好，应降低酶量或调换另一来源的酶。
（4）退火温度偏低，退火及延伸时间偏长。应提高退火温度，减少变性与延伸时间，也可采用二种温度的PCR扩增。以2度为梯度设计梯度PCR反应优化退火温度。
（5）样品处理不当。
（6）Mg2+浓度偏高，因适当调整Mg2+使用浓度。
（7）若为PCR试剂盒，也可能时试剂盒本身质量有问题。
（8）复制提前终止。使用非热启动的聚合酶时常有发生。冰上准备反应体系或采用热启动聚合酶。
（9）反应缓冲液未完全融化或未充分混匀。确保反应缓冲液融化完全并彻底混匀。
（10）引物特异性差。利用BLAST检查引物特异性或重新设计引物。
（11）引物量过多。减少反应体系中引物的用量。
（12）模板量过多。质粒DNA的用量应<50ng，而基因组DNA则应<200ng。
（13）外源DNA污染。确保操作的洁净。
1、扩增产物在凝胶中涂布或成片状条带弥散
（1）酶量过高。减少酶量；酶的质量差，调换另一来源的酶。
（2）dNTP浓度过高。减少dNTP的浓度。
（3）MgCl2浓度过高。可适当降低其用量。
（4）模板量过多。质粒DNA的用量应<50ng，而基因组DNA则应<200ng。
（5）引物浓度不够优化。对引物进行梯度稀释重复PCR反应。
（6）循环次数过多；增加模板量减少循环次数至30，缩短退火时间及延伸时间，或改用二种温度的PCR循环。
（7）退火温度过低。
（8）电泳体系有问题：
①凝胶中缓冲液和电泳缓冲液浓度相差太大；
②凝胶没有凝固好；
③琼脂糖质量差。
（9）若为PCR试剂盒则可能：
①由于运输储存不当引起试剂盒失效；
②试剂盒本身质量有问题，如引物选择、循环参数等选择不当。
（10）降解的陈旧模板扩增也易产生涂布。
2、. 扩增产物出现多条带（杂带）
（1）引物用量偏大，引物的特异性不高。应调换引物或降低引物的使用量。
（2）循环的次数过多。适当增加模板的量，减少循环次数。
（3）酶的用量偏高或酶的质量不好，应降低酶量或调换另一来源的酶。
（4）退火温度偏低，退火及延伸时间偏长。应提高退火温度，减少变性与延伸时间，也可采用二种温度的PCR扩增。以2度为梯度设计梯度PCR反应优化退火温度。
（5）样品处理不当。
（6）Mg2+浓度偏高，因适当调整Mg2+使用浓度。
（7）若为PCR试剂盒，也可能时试剂盒本身质量有问题。
（8）复制提前终止。使用非热启动的聚合酶时常有发生。冰上准备反应体系或采用热启动聚合酶。
（9）反应缓冲液未完全融化或未充分混匀。确保反应缓冲液融化完全并彻底混匀。
（10）引物特异性差。利用BLAST检查引物特异性或重新设计引物。
（11）引物量过多。减少反应体系中引物的用量。
（12）模板量过多。质粒DNA的用量应<50ng，而基因组DNA则应<200ng。
（13）外源DNA污染。确保操作的洁净。
