虾虹彩病毒探针法荧光定量PCR试剂盒使用说明书
产品及特点
虹彩病毒科宿主范围广泛，可感染脊椎动物和无脊椎动物，它们在水生物种中广泛分布，可能导致大规模损失。它可感染四脊滑螯虾（Cherax quadricarinatus）、凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）、罗氏沼虾（Macrobrachium rosenbergii）、日本沼虾（Macrobrachium nipponense）、克氏原螯虾（Procambarus clarkii）、脊尾白虾（Exopalaemon carinicauda）、中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis）和粗腿厚纹蟹（Pachygrapsus crassipes）等。本产品就是以探针法荧光定量PCR技术为基础开发的专门检测虾虹彩病毒的试剂盒，它具有下列特点：
■ 即开即用，用户只需要提供样品DNA模板。
■ 引物和探针经过优化，灵敏性高。
■ 提供阳性对照，便于区分假阴性样品。
■ 特异性高，引物是根据虾虹彩病毒DNA高度保守区设计，不会跟其他微生物的DNA发生交叉反应。
■ 既可用于定性检测，又可用于定量检测。用于定量检测时线性范围至少为5个数量级。
■ 本产品足够50次20μL体系的探针法荧光定量PCR反应。
■ 本产品只能用于科研。
格及成分
运输及保存
低温运输，-20℃保存，保存期限为12个月。
自备试剂
样品DNA。
使用方法
一、稀释标准曲线样品（以10E1-10E6拷贝/μL这6个10倍稀释度为例）。由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供无传染性的DNA片段作为阳性对照。
■ 标记6个离心管，分别为6，5，4，3，2，1。
■ 用带芯枪头分别加入45 μL荧光PCR专用模板稀释液，最好用带芯枪头，下同。
■ 在6号管中加入5 μL 1×10E7拷贝/μL 的阳性对照(试剂盒提供)，充分震荡1分钟，得1×10E6拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
■ 换枪头，在5号管中加入5 μL 1×10E6拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10E5拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
■ 换枪头，在4号管中加入5 μL 1×10E5拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10E4拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
■ 重复上面的操作直到得到6个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。
二、样品DNA的制备
■ 如果有N个样品待提取，最好设置N+2个提取，多出的是PC（样品制备阳性对照）和NC（样品制备阴性对照）。可以取阳性对照的1000倍稀释液10μL再加上一定量的水，使总体积与待提取样品的规定体积一致，以此作为PC。另外用水作为NC。
■ 用自选方法纯化样品的DNA，本试剂盒跟市场上大多数DNA提取试剂盒兼容。
三、Probe qPCR反应（20μL体系，在样品制备室进行）
■ 如果做定量分析并且只做1次重复，则标记N+9个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照（用水做模板），6个用于标准曲线。如果做定性分析，并且只做1次重复，则标记N+4个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照（用水做模板），1个用于PCR阳性对照（用第4号管的阳性对照稀释液做模板）。下面只以定量分析为例描述操作步骤。
■ 在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后最后加）：
■ 盖上盖子后上机，按下面参数进行PCR：
四、数据处理
■ 如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的log值为横轴，以Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的Ct值从标准曲线上推算出样品核酸浓度的log值，再推算出其浓度。
■ 如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照Ct必须大于或等于40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct值应该小于或等于39。对待测样品，如果其Ct大于或等于40则为阴性，如果小于或等于39则为阳性。如果在39-40之间，则重复一次。重复实验的Ct值如果大于或等于40则为阴性，如果小于40，则为阳性。
虹彩病毒科宿主范围广泛，可感染脊椎动物和无脊椎动物，它们在水生物种中广泛分布，可能导致大规模损失。它可感染四脊滑螯虾（Cherax quadricarinatus）、凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）、罗氏沼虾（Macrobrachium rosenbergii）、日本沼虾（Macrobrachium nipponense）、克氏原螯虾（Procambarus clarkii）、脊尾白虾（Exopalaemon carinicauda）、中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis）和粗腿厚纹蟹（Pachygrapsus crassipes）等。本产品就是以探针法荧光定量PCR技术为基础开发的专门检测虾虹彩病毒的试剂盒，它具有下列特点：
■ 即开即用，用户只需要提供样品DNA模板。
■ 引物和探针经过优化，灵敏性高。
■ 提供阳性对照，便于区分假阴性样品。
■ 特异性高，引物是根据虾虹彩病毒DNA高度保守区设计，不会跟其他微生物的DNA发生交叉反应。
■ 既可用于定性检测，又可用于定量检测。用于定量检测时线性范围至少为5个数量级。
■ 本产品足够50次20μL体系的探针法荧光定量PCR反应。
■ 本产品只能用于科研。
格及成分
| 成分 | 编号 |
| A | 190303 |
| B | 180701 |
| C | 100935 |
| D | 15-75430yp |
| E | 75430pc |
| 使用手册 | 15-75430sc |
运输及保存
低温运输，-20℃保存，保存期限为12个月。
自备试剂
样品DNA。
使用方法
一、稀释标准曲线样品（以10E1-10E6拷贝/μL这6个10倍稀释度为例）。由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供无传染性的DNA片段作为阳性对照。
■ 标记6个离心管，分别为6，5，4，3，2，1。
■ 用带芯枪头分别加入45 μL荧光PCR专用模板稀释液，最好用带芯枪头，下同。
■ 在6号管中加入5 μL 1×10E7拷贝/μL 的阳性对照(试剂盒提供)，充分震荡1分钟，得1×10E6拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
■ 换枪头，在5号管中加入5 μL 1×10E6拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10E5拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
■ 换枪头，在4号管中加入5 μL 1×10E5拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10E4拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
■ 重复上面的操作直到得到6个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。
二、样品DNA的制备
■ 如果有N个样品待提取，最好设置N+2个提取，多出的是PC（样品制备阳性对照）和NC（样品制备阴性对照）。可以取阳性对照的1000倍稀释液10μL再加上一定量的水，使总体积与待提取样品的规定体积一致，以此作为PC。另外用水作为NC。
■ 用自选方法纯化样品的DNA，本试剂盒跟市场上大多数DNA提取试剂盒兼容。
三、Probe qPCR反应（20μL体系，在样品制备室进行）
■ 如果做定量分析并且只做1次重复，则标记N+9个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照（用水做模板），6个用于标准曲线。如果做定性分析，并且只做1次重复，则标记N+4个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照（用水做模板），1个用于PCR阳性对照（用第4号管的阳性对照稀释液做模板）。下面只以定量分析为例描述操作步骤。
■ 在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后最后加）：
| 成分/每管 | 样品管 N+2个 |
PCR阴性对照管 | 标准曲线 样品管（1-6管） |
| A | 10 μL | 10 μL | 10 μL |
| D | 3 μL | 3 μL | 3 μL |
| N+2个待测DNA模板 | 7 μL | - | - |
| C | - | 7 μL | - |
| 第6步所得标准曲线样品稀释液（1-6号） | - | - | 7 μL（1号样到1号管，2号样到2号管…） |
| 过程 | 温度 | 时间 |
| 预变性 | 95℃ | 10 min |
| PCR反应 （45个循环） |
95℃ | 15 sec |
| 60℃ | 60 sec（采集FAM通道的荧光信号） |
■ 如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的log值为横轴，以Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的Ct值从标准曲线上推算出样品核酸浓度的log值，再推算出其浓度。
■ 如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照Ct必须大于或等于40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct值应该小于或等于39。对待测样品，如果其Ct大于或等于40则为阴性，如果小于或等于39则为阳性。如果在39-40之间，则重复一次。重复实验的Ct值如果大于或等于40则为阴性，如果小于40，则为阳性。
