细小病毒B19探针法荧光定量PCR试剂盒使用说明书

产品及特点：
细小病毒B19(Parvovirus B19)引起的典型疾病是传染性红斑和急性关节病，在妊娠妇女可引起胎儿水肿乃至死胎。因此快速灵敏检测细小病毒B19有重要意义。本产品就是以探针法荧光定量 PCR 技术为基础开发的专门检测细小病毒B19的试剂盒，它具有下列特点：

■即开即用，用户只需要提供样品DNA模板。

■引物和探针经过优化，灵敏性高。

■提供阳性对照，便于区分假阴性样品。

■特异性高，引物是根据细小病毒B19高度保守区设计，不会跟其他病毒的DNA发生交叉反应。

■本产品足够50次20μL体系的探针法荧光定量PCR反应。

■本产品只能用于科研。

 

成分	编号	五孔盒包装
2×Probe qPCR MagicMix	190303	500 μL（本色盖）
荧光PCR专用模板稀释液	180701	1 mL（红盖）
超纯水	100935	1 mL（紫盖）
细小病毒B19探针法qPCR引物-探针混合液	yp15-30900	150 μL（棕色管）
细小病毒B19探针法qPCR阳性对照(1×10E7拷贝/μL)	pc30900	50 μL（黄盖）
使用手册	15-30900sc	1份

运输及保存
低温运输，-20℃保存，保存期限为12个月。

自备试剂
样品DNA。

使用方法
一、稀释标准曲线样品（以10E1-10E6拷贝/μL这6个10倍稀释度为例）。由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供无传染性的DNA片段作为阳性对照。

■标记6个离心管，分别为6，5，4，3，2，1。

■用带芯枪头分别加入45 μL荧光PCR专用模板稀释液，最好用带芯枪头，下同。

■在6号管中加入5 μL 1×10E7拷贝/μL 的阳性对照(试剂盒提供)，充分震荡1分钟，得1×10E6拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。

■换枪头，在5号管中加入5 μL 1×10E6拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10E5拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。

■换枪头，在4号管中加入5 μL 1×10E5拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10E4拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。

■重复上面的操作直到得到6个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。

二、样品DNA的制备

■如果有N个样品待提取，最好设置N+2个提取，多出的是PC（样品制备阳性对照）和NC（样品制备阴性对照）。可以取阳性对照的10000倍稀释液10μL再加上一定量的水，使总体积与待提取样品的规定体积一致，以此作为PC。另外用水作为NC。

■用自选方法纯化样品的DNA，本试剂盒跟市场上大多数DNA提取试剂盒兼容。也可以选购本公司的柱式病毒DNAout。

三、Probe qPCR反应（20μL体系，在样品制备室进行）

■如果做定量分析并且只做1次重复，则标记N+9个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照（用水做模板），6个用于标准曲线。如果做定性分析，并且只做1次重复，则标记N+4个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照（用水做模板），1个用于PCR阳性对照（用第4号管的阳性对照稀释液做模板）。下面只以定量分析为例描述操作步骤。

■在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后最后加）：

成分	样品管 N+2个	PCR阴性对照管	标准曲线 样品管（1-6管）
2×Probe qPCR MagicMix	10 μL	10 μL	各10 μL
细小病毒B19探针法qPCR引物-探针混合液	3 μL	3 μL	各3 μL
N+2个待测DNA模板	7 μL	-	-
超纯水	-	7 μL	-
第6步所得标准曲线样品稀释液（1-6号）	-	-	各7 μL（1号样到1号管，2号样到2号管…）

■盖上盖子后上机，按下面参数进行PCR：

过程	温度	时间
预变性	95℃	5 min
PCR反应 （45个循环）	95℃	15sec
	60℃	60sec（采集FAM通道的荧光信号）
按仪器预设程序进行熔解曲线分析

■如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的log值为横轴，以Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的Ct值从标准曲线上推算出样品RNA浓度的log值，再推算出其浓度。

■如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照Ct必须大于或等于40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct值应该小于或等于35。对待测样品，如果其Ct大于或等于40则为阴性，如果小于或等于35则为阳性。如果在35-40之间，则重复一次。重复实验的Ct值如果大于或等于40则为阴性，如果小于40，则为阳性。