纳米抗体淘选体系选择介绍

噬菌体展示技术由乔治-史密斯（George P. Smith）于 1985 年最早描述，他报道了在丝状噬菌体（感染细菌的细长病毒）上展示肽的方法，即从一系列肽序列中将病毒的外壳蛋白与一种肽融合。1988 年，斯蒂芬-帕姆雷（Stephen Parmley）和乔治-史密斯描述了用于亲和力筛选的生物淘筛（biopanning），并证明逐轮筛选可以富集出十亿分之一或更少出现的克隆。1990年，吉米-司各特（Jamie Scott）和乔治-史密斯描述了在丝状噬菌体上展示的大型随机肽库的创建过程。格雷格-温特（Greg Winter）和约翰-麦卡弗蒂（John McCafferty）所在的分子生物学实验室、理查德-勒纳（Richard Lerner）和卡洛斯-巴巴斯（Carlos Barbas）所在的斯克里普斯研究所以及弗兰克-布赖特林（Frank Breitling）和斯特凡-杜贝尔（Stefan Dübel）所在的德国癌症研究中心的研究小组进一步开发和改进了噬菌体展示技术，用于展示治疗蛋白质工程中的抗体等蛋白质。史密斯和温特因开发噬菌体展示技术的贡献而获得了 2018 年诺贝尔化学奖的一半份额。1985 年，乔治-皮克泽尼克（George Pieczenik）要求优先权的一项专利也描述了肽库的生成过程。

噬菌体抗体库技术是目前应用广泛的基因工程抗体制备技术，在人源抗体的克隆、抗体性能的修饰、抗体基因的研究等方面具有重要的理论和实用价值。抗体库展示技术的筛选能力为其应用发展奠定了基础。而能否从抗体库中获得预期的抗体受到很多因素的制约，包括抗体库的存储容量、多样性、存储条件、扩增和筛选流程等，筛选策略需要根据抗原的性质来确定。其他筛选策略的选择依据如下文所述：

抗原性质明确时，使用固相筛选法和液相筛选法。

固相筛选法通过将抗原包被在酶标板或其他固相介质上来富集表达高亲和性抗体的噬菌体。该法有两种筛选方式：ELISA微孔板筛选和免疫试管筛选。当抗体库容量较大，预期目标抗体的拷贝数较多，亲和力较强且抗原来源丰富时，固相抗原筛选法最常用。固相筛选法的缺点有：消耗大量抗原、部分抗原与固相介质结合后会破坏表位、不易定量、对抗体亲和力的选择效果不佳。因此，在抗原有限等以上这些情况下可以选择液相筛选法。

液相筛选法是在与亲和素偶联的磁珠或琼脂糖上包被生物素化的抗原进行抗体筛选。液相筛选法的筛选效率高，增加了噬菌体颗粒与抗原接触的机率，能有效地将数量少或亲和力低的抗体从文库中分离出来。通过多次筛选，可以得到表达高亲和力抗体的噬菌体。

抗原无法纯化或性质未知时，就需要开发新的筛选方法来建立噬菌体展示抗体库。目前比较成熟的有细胞筛选方法、组织筛选或体内筛选方法、选择感染筛选方法、蛋白质芯片筛选方法等。

细胞筛选方法可以保持抗原和抗体的天然构象，多用于肿瘤细胞抗体筛选，还适用于细胞表面受体及抗原鉴定。而由于细胞膜成分复杂，会增加非特异性结合，因此需要去除非特异性结合的背景。最常用的去除背景的方法是用不表达特异性抗原的细胞（空白细胞）预吸附抗体库，去除非目标抗体（负选择），然后用吸附的噬菌体结合目标抗体。靶细胞获得靶细胞结合抗体（正选择），经过几轮“负选择-正选择-扩增”，针对靶分子的抗体噬菌体被富集。但多次筛选容易丢失特异性结合的抗体噬菌体，丧失多样性。因此该方法的应用并不广泛，在此方法基础上开发了扣除筛选、竞争筛选、内化筛选等方法。

组织筛选或体内筛选方法多用于临床研究。组织筛选方法是利用新鲜的组织切片进行抗体筛选，但由于组织本身抗原数量有限，限制了噬菌体抗体的回收效率。体内筛选方法是将待筛选抗体库通过静脉注射进小鼠体内，然后取出组织或靶器官，回收噬菌体，经过3-4轮的富集可得到特异性抗体。与体外筛选相比，此类组织和细胞处于天然的三维微环境中，筛选结果更加真实。但体内筛选效率低、筛选难度大、对文库要求较高——通常要求文库的多样性达到10⁸-10⁹。同时，应尽量减少空噬菌体的含量。

选择感染筛选法是将PⅢ蛋白的氨基端结构域（NT）用特定的多肽或蛋白替代，然后这些多肽或蛋白与带有NT端的配基特异性结合时，才会有感染能力，因此在细菌细胞内繁殖富集，得到特异性抗体。

蛋白芯片筛选法利用高通量蛋白功能分析技术，将有大量不同种类的蛋白质点样在载体上，可同时检测这些抗原抗体的反应，通过扫描仪读取荧光强度，可以利用计算机对待测样品进行分析计算。蛋白质芯片不仅具有高通量的特点，还可以高灵敏性和低假阳性的筛选抗体。