肿瘤干细胞的分离与鉴定

肿瘤干细胞对肿瘤的存活、增殖、转移及复发有着重要作用。从本质上讲，肿瘤干细胞通过自我更新和无限增殖维持着肿瘤细胞群的生命力。

一、肿瘤干细胞的特性

1、具有无限增殖和分化潜能

肿瘤的发生是一个长期的突变积累过程，在皮肤及肠黏膜上皮等肿瘤的高发部位，衰老细胞不断地死去并脱离机体，只有干细胞是唯一可以长期存在的细胞，有可能积累多次突变而生成肿瘤干细胞，进而最终形成肿瘤。

2、比例小

肿瘤干细胞主要通过两种方式分裂：

一种是对称分裂，即形成两个相同的肿瘤干细胞或两个相同的分化肿瘤细胞；

另一种是非对称分裂，即肿瘤干细胞分裂后形成的两个细胞中有一个细胞不可逆地走向分化的终端成为功能专一的分化肿瘤细胞，而另一个保持亲代的特征，仍作为肿瘤干细胞保留下来。由于这种类似于干细胞的分裂方式，低密度的肿瘤干细胞能在维持自身数量的同时产生出分化的肿瘤细胞。

3. 具有高端粒酶活性

高活性的端粒酶可抑制细胞增殖过程中端粒长度的缩短，延长肿瘤干细胞的增殖寿命，这为肿瘤干细胞的不断增殖和分化提供了基础条件。

4. 抗凋亡家族蛋白过表达

研究发现，大部分肿瘤干细胞中抗凋亡基因 Bcl- 2 的表达量显著增加，从而启动肿瘤干细胞内抗凋亡程序，阻断 Bid 和 Bad 等促凋亡蛋白引起的线粒体凋亡途径，并进一步阻断胱天蛋白酶凋亡途径，防止肿瘤干细胞发生凋亡。

5. DNA 修复能力显著增强

研究发现，肿瘤干细胞内与 DNA 损伤修复相关的核酸内切酶、DNA 聚合酶和 DNA 连接酶等酶蛋白的合成增加、活性增强，增强了肿瘤干细胞的抗 DNA 损伤能力，使得肿瘤干细胞可逃避以 DNA 损伤为主的肿瘤治疗手段。

6. 长时间处于 G0 期

临床上普遍使用的化疗药物主要是针对增殖旺盛的肿瘤细胞进行杀伤，处在 G0 期的大多数肿瘤干细胞能逃避传统肿瘤治疗方法的杀伤，一旦时机成熟或停止用药，它们便成为复发的根源。

7. 处于低氧环境中

肿瘤干细胞通常位于由发育良好的三维细胞外基质包裹的低氧环境中，这些细胞外基质起到很好的屏障作用，尽可能避免了肿瘤干细胞接触到抗肿瘤药物。同时由于射线引起的 DNA 损伤需要氧气，所以肿瘤干细胞所处的低氧环境使得放疗对肿瘤干细胞的杀伤作用也非常局限旧。

8. 表达干细胞特异标志物

这些特异性蛋白或标志物在肿瘤干细胞的增殖、肿瘤干细胞分化成肿瘤组织周围所必须的血管等组织、肿瘤干细胞的迁移等过程中发挥至关重要的作用。利用这些特异性的表面标志物达到肿瘤干细胞分离或鉴定的目的。

二、肿瘤干细胞分离

1. 免疫磁珠分选（MACS）

MACS 是基于肿瘤干细胞表面特异性抗原能与连接有磁珠的特异性单克隆抗体相结合，之后在外部磁场的作用下，连接有单克隆抗体磁珠的肿瘤干细胞停留在磁场中，而无特异性表面抗原的肿瘤细胞则不能与免疫磁珠结合，因而不能在磁场中停留，从而得以分离出肿瘤干细胞。

2. 流式细胞分选（FACS）

FACS 是通过将待分选的肿瘤细胞和肿瘤干细胞用同一种或多种荧光素标记的特异性抗体标记，根据肿瘤干细胞与肿瘤细胞结合荧光素标记抗体能力的差异，通过流式细胞仪将肿瘤干细胞分选出来的方法。

3. 根据生物学特性分离

根据肿瘤干细胞具有的某些生物学特性将肿瘤干细胞分离筛选出的方法。如可以通过细胞核对核染料的拒染性质、肿瘤干细胞体外培养所需的特殊条件等特性，分离出肿瘤干细胞。

4. 旁群细胞分选法 (SP)

肿瘤干细胞具有对核染料 Hoechst 33342 拒染的特性。Hoechst 33342 是一种核酸染料，在紫外光激发下可发出蓝色荧光 (波长 450 nm 左右) 和红色荧光 (波长 650 nm 左右)，肿瘤干细胞可将染料外排，而不发出荧光，从而可将这类旁群细胞分离出来。

5. 无血清培养基分选法 (SFM)

在合成培养基的基础上，引入特定的生 长因子和细胞添加剂，使绝大多数肿瘤细胞由于缺乏生长所必须的血清成分而停止生长。

经长时间培养后最终死亡，而肿瘤干细胞则可以在含特定生长因子和添加剂的无血清培养基中呈球状悬浮生长。

经几代的培养增殖形成富含肿瘤于细胞的肿瘤细胞球在合成培养基的基础上，引入特定的生长因子和细胞添加剂，使绝大多数肿瘤细胞由于缺乏生长所必须的血清成分而停止生长。

经长时间培养后最终死亡，而肿瘤干细胞则可以在含特定生长因子和添加剂的无血清培养基中呈球状悬浮生长，经几代的培养增殖形成富含肿瘤于细胞的肿瘤细胞球。

6. 联合多种方法分离

在目前的研究中，肿瘤干细胞的分离并不是采用单一的方法，而是选用两种或者两种以上的分离方法，以获得数量更多、纯度更高的肿瘤干细胞。

三、肿瘤干细胞鉴定

1. 利用肿瘤干细胞特异性表面标志物进行鉴定

目前，肿瘤干细胞最为广泛且可靠的鉴定方法就是利用肿瘤干细胞特异性表面标志物。将分离出的肿瘤干细胞通过免疫组织化学法、流式细胞检测技术等方法测定阳性或阴性细胞表面标志物表达情况，进而鉴定是否是肿瘤干细胞。

2.异种移植成瘤性实验鉴定

将分离出的肿瘤于细胞，制备成细胞悬液后种植到异种动物体内，如将人的肿瘤干细胞接种于 NOD/SCID 小鼠体内，观察其能否形成肿瘤病灶，且异种动物体内形成的肿瘤病灶在组织学结构上与原发肿瘤病灶类似，则可鉴定为肿瘤干细胞。一般来说，肿瘤干细胞形成肿瘤病灶所需的细胞密度比普通肿瘤细胞要小。

3. 肿瘤干细胞的其他鉴定方法

对于肿瘤干细胞的鉴定，还可通过肿瘤干细胞具有的类干细胞特性进行鉴定。

如根据肿瘤干细胞核对核染料拒染 (如 Hoechst 33342 染料) 的性质进行鉴定；

根据肿瘤干细胞长期处于静止状态的特性，应用溴脱氧尿嘧啶核苷法进行鉴定和软琼脂克隆形成实验鉴定等。

四、细胞成瘤性质控-端粒酶活性检测方法

端粒酶催化亚基TERE表达量检测试剂盒（QPCR法）

产品说明：端粒酶 (Telomerase ) 是一种酶促核糖核蛋白复合物。其催化亚基 (TERT) 具有逆转录酶的特性，TERT被认为是端粒酶活性表达的关键组分，其编码的mRNA水平与端粒酶活性一致，与端粒酶的活化程度密切相关。因此，对端粒酶催化亚基的检测可以间接反映样本中端粒酶活性。

本产品试剂盒采用双色荧光qPCR (TaqMan探针法) 检测端粒酶催化亚基TERT基因和内参基因GAPDH 。通过提取细胞RNA ，利用特异性逆转录引物进行逆转录反应， 以cDNA为模板在单管中利用多重荧光定量PCR进行扩增反应 (双重探针：FAM 、Cy5) 。选用293T细胞为阳性对照以及MRC-5细胞为阴性对照，判断样本中是否有TERT基因表达。该试剂盒具有以下特点：

1. 灵敏：双色探针，灵敏度高。

2. 稳定：全程闭管操作，无交叉污染。

3. 可靠：含内参基因，避免假阴性。

4. 方便：操作简单，无需电泳步骤。

5. 定量： 以CT值判断，可定量检测。