解决中药入血后的微量代谢物鉴定难题延胡索
体内吸收的药物成分及相关代谢物是疾病治疗的有效物质基础。因此，解读中草药中多种成分的代谢物对揭示药效学成分具有重要意义。但中草药的化学成分多为低含量的次生代谢物，其体内代谢物含量接近微量，难以实现全面的检测和鉴定。延胡索（中国延胡索）的干根茎，具有促进血液循环、促气、止痛等作用。对延胡索生物碱的综合代谢谱的研究较少，加上分析方法的固有局限，代谢物尚未完全发现，延胡索的药效成分也尚不清楚。目前迫切需要一种有效的代谢物检测和鉴定方法。
北京中医药大学药学院高教授课题组在Journal of Pharmaceutical Analysis发表的题为 “Corydalis Rhizoma as a model for herb-derived trace metabolites exploration: A cross-mapping strategy involving multiple doses and samples”（IF：14.026）的研究成果。研究以延胡索为模型，采用：分析高剂量草药提取物的代谢物，表征同一生物样品中临床剂量草药提取物的代谢物；基于不同生物样品中代谢物具有不同离子丰度的事实，应用不同生物样品的交叉图谱来鉴定微量代谢物两种方法。与不使用该策略相比，多检出44种临床剂量的草药提取物代谢物。这项研究提高了目前草药衍生代谢物表征方法的深度、广度和准确性。
延胡索作为草药衍生微量代谢产物探索的模型：一种涉及多剂量和样本的交叉映射策略
研究对象：延胡索
发表期刊：Journal of Pharmaceutical Analysis
影响因子：14.026
合作单位：北京中医药大学药学院、华西医院消化内科
运用生物技术：UPLC-Q-TOF/MS液质联用
04研究思路
图1. 延胡索生物碱代谢物鉴定所提出的分析策略汇总图
05研究方法1.实验材料：
植物：延胡索；化学试剂：LC/MS级的水，甲酸、乙腈、甲醇四氢小檗碱、棕榈碱标准品。动物：雄性SD大鼠（200±10）。
2. 样本数量及分组：
2.1 大鼠分组：38只大鼠分三组，粪便和尿组（12）、血浆组（¼12）和胆汁组（14）。粪便组和尿液组大鼠分为6组，分别口服4个参考标准品（2.00 mL，20mg/kg）、临床剂量（0.56 mL）和大剂量（1.20 mL），分别采集12只大鼠给药前后24 h的粪便和尿样。血浆组：分组给药方式同上，收集13个时间点血浆样本。胆汁组：分组及给药同，另多有2只大鼠为空白对照。10%水合氯醛麻醉进行胆管插管，收集胆汁0-12h和12-24h样本。存于-80℃。
2.2 延胡索样品准备：研磨成粉过40目筛，将约20 g粉末在200 mL蒸馏水中浸泡1h，煎煮2次，每次30 min。合并提取液，最终溶解成40mL，相当于0.5g中药（药典中延胡索的临床口服剂量为3-10g/人，因此，延胡索的临床剂量为1.4 g/kg，即0.28g/大鼠（0.56 mL）。大剂量为3 g/kg，即0.6g/大鼠（1.2 mL)。
2.3 血液、尿液和胆汁样本的制备：样品解冻后，各时间点混合200 uL血浆。将适量的混合样品（血浆100 uL，尿液1 mL，胆汁150 uL）与三倍量的甲醇混合。涡旋30s后在4℃，12000rpm离心10min去除蛋白。上清液氮气干燥，70%甲醇复溶并离心15min，取上清液用于UPLC-Q-TOF/MS分析。
2.4 粪便样品制备：200 mg粪便在4 mL甲醇中涡旋30 s，放置1h。然后在4℃，12000rpm离心15 min，上清液用氮气干燥。甲醇复溶，离心15 min。上清液用于UPLC-Q-TOF/MS分析。
3. 采用的技术：
Waters UPLC Class液相系统联用Waters SYNAPT G2-SI MS质谱系统。采用MassLynx V4.1软件控制仪器并采集数据，UNIFI软件进行数据处理。其实验流程设计见图1。
06研究结果
1. 母体化合物的碎裂模式
母体药物和相关代谢物通常具有相同的骨架，其碎裂模式相似。为了更好地利用LC-MS技术对代谢物进行分析，有必要充分了解母体化合物的碎裂方式。延胡索生物碱主要分为四氢小檗碱、原小檗碱。
图S1. 四氢小檗碱的MS/MS谱及其特征性裂解途径
图S2. 延胡索乙素的MS/MS谱及其特征性裂解途径
如图S1和S2示，四氢小檗碱和延胡索乙素均有饱和C环，易发生RDA裂解，四氢小檗碱相似，也易发生RDA裂解（图S3）。RDA裂解后通过进一步脱水形成最丰富的片段离子。而棕榈碱C环不饱和，极难形成RDA裂解（图S4）。酰胺基中存在弱键，因此阿朴啡型生物碱很容易失去（CH3）2NH或CH3NH2取代基，产生最丰富的[M-45.0578]+或[M-31.0344]+片段作为特征离子（图S5）。
图S3. MS/MS谱及其特征性裂解途径
图S4. 棕榈碱的MS/MS谱及其特征性裂解途径
图S5. MS/MS谱及其特征性裂解途径
2. 代表性化合物的代谢研究
选择四氢小檗碱、延胡索乙素、棕榈碱并根据文献总结的母体代谢途径鉴定这些成分的代谢途径（图2）。四种具有代表性化合物的所有代谢物均列于表S1-S4（补充材料）。基于MS信息和标准品中总结的代谢途径，提出了MCFs来表征延胡索提取物的代谢产物（表1）。
图2. (A)四氢小檗碱、(B)延胡索乙素
3. 建立化学结构筛选表
值得注意的是，研究发现延胡索生物碱的骨架在代谢过程中没有变化。因此，根据替代品的类型和数量以及体内代谢途径总结了化学结构筛选表（表2-4），为结构鉴定提供参考。表4. 原小檗碱化学结构筛选表（篇幅原因，此处只放表4，表2-3模式同此表）红色数字表示与延胡索代谢产物匹配的准分子离子。
4. 延胡索衍生化合物的综合鉴定
4.1初筛中检测到的代谢物的鉴定：以临床剂量延胡索提取物血浆样品中的代谢产物MN-100为例说明了鉴定过程（图3）。在正离子模式下，准分子离子为m/z504.1881[M+H]+，化学式为C25H29NO10。碎片离子m/z328.1548[M+H]+是葡萄糖醛酸化的代谢物，并在表2中检索到分子离子及7种对应的代谢物结构。表明MN-100与四氢小檗碱具有相同的骨架，在C2-C3位置有两个羟基取代，在C13位置有一个甲基取代，在C9-C10位置有一个葡萄糖醛酸和一个甲氧基。MN-100的质谱图及结构图如图4所示。
图3. 临床延胡索提取液给药血浆样品的色谱图
(A)m/z 504.1881的提取物离子色谱图
(B)血浆样品的总离子色谱图
表2. 四氢小檗碱化学结构筛选表
图4. MN-100的质谱和结构
4.2以高剂量延胡索提取物的代谢物为伪标准来鉴别临床剂量的方法：图5A中的代谢物MN-106由于丰度低、峰形差，在初筛中未检测到。然而，在相同的保留时间，高剂量血浆样品中的代谢产物MH-119被鉴定为甲基化和葡萄糖醛酸化的延胡索乙素。临床剂量和高剂量提取物的血浆样本中m/z 518.2028的EICs如图5A所示。在MS/MS谱（图5B）中，临床剂量提取物样品中的碎片离子响应值较低，几乎淹没在基线中，但具有与高剂量样品中相同的碎片模式，说明临床剂量提取物样品中也存在MH-119。
图5. 在临床剂量和高剂量提取物的血浆样品中
m/z 518.2028的提取物离子色谱(A)和MS/MS光谱(B)
4.3通过对不同生物样本的交叉定位，鉴定不同样品中的微量代谢物：同一生物样品在不同剂量下获得的代谢物几乎完全一致，因此该方法有助于对同一样品中的代谢物的鉴定。通过保留时间和m/z值，将一个样品中丰度较强的代谢物相应地映射到其他三个样品中，从而可以识别出不同样品中的微量代谢物。以临床剂量延胡索血浆样本中的代谢物MN-28和MN-29为例，说明该策略。如图6A和B所示，在不同剂量的血浆样品中，这两个峰的MS响应很弱。
图6. m/z 342.1715的提取物离子色谱图
(A)临床剂量血浆样本(B)高剂量血浆样本和
(C)临床剂量尿液样本
从高剂量到临床剂量的方法不能从血浆样本中识别，在尿液样本中检测到6种准分子离子342.1715[M+H]+的代谢物。在尿样的初筛结果中，保留时间分别为9.05 min和9.83 min的峰被鉴定为氢化四氢小檗碱。在m/z178.0859[M+H-C10H12O2]+处的片段离子反应表明其结构与四氢小檗碱相似，在表2中搜索了理论准分子离子m/z 342.1705，四氢小檗碱骨架的C-2、C-3、C-9和C-10处可能有3个甲氧基和1个羟基，表明氢化反应发生在A环，其结构及质谱如图7示。如图6A和B所示，从血浆样品中提取m/z 342.1715的离子，与在尿液中相同的保留时间内获得四个具有相同m/z值的色谱峰（图6C）。
图7. MN-28和MN-29的质谱和结构
4.4延胡索生物碱的结构与代谢的关系：延胡索生物碱的结构与代谢密切相关。去甲基化是最常见和频率最高的代谢反应。从图8可以看出，棕榈碱在甲氧基取代时最容易发生去甲基化，其次是延胡索乙素、四氢小檗碱甲基化反应则相反。其余的羟基容易发生硫酸盐化和葡萄糖醛酸化。葡萄糖醛酸化和硫酸化反应只发生过一次，而不是同时发生。只有两种代谢物被检测到被硫酸化两次。
图8.四个参考标准中代谢物类型的相对百分比
含亚甲基二氧基的组分会失去一个CO分子，而不含取代基的组分不会发生裂解，如延胡索乙素和棕榈碱的情况所示。生物碱的五元含氧环和碳基易于氢化。前者变成一个甲氧基和一个羟基，后者变成一个羟基。羟基不稳定，容易发生脱羟基化。二羟基化在其他结构类型中没有发生。原小檗碱型生物碱由于不饱和C环而没有发生RDA裂解。因此，其结构难以确定，在代谢过程中非常稳定。棕榈碱只发生去甲基化和羟基化反应，代谢产物主要分布在粪便中，而不是分布在胆汁中，提示它可能是由肠道而不是肝脏代谢的。
06研究结论
研究采用不同样品和剂量的交叉组合，从临床标准剂量和从高剂量到临床剂量的策略中检测到127种代谢物。将化学结构筛选表与特征片段离子相结合，阐明了代谢物的结构。绘制了四种代表性标准品在大鼠体内更准确的代谢途径，并论证了延胡索生物碱的结构与代谢之间的关系。
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