PCR引物设计优化需考虑方面
PCR引物设计，核心目的是为了追求扩增特异性和扩增效率。我们将从以下几个方面考虑问题。
1．引物的长度
引物越长，特异性越好，但是更难与模板链结合，因此更难反应，扩增效率更低。此外，引物的长度还由DNA复制酶决定，并且与退火温度有关
一般的，引物长度为18-30bp；
2．GC含量
Tm值（melting temperature）是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度。Tm值与GC值相互联系，引物的熔化温度（Tm）介于 65°C 和 75°C 之间，当Tm值为72℃时，复性条件最佳。，对应的，目标 GC 含量在 40% 至 60% 之间。
对于上下游引物，两种引物之间应该CG含量与Tm值相差不大。若差别较大，可以添加额外的AT在DNA聚合酶不作用的引物5’端。
3．引物末端（3’）的设计
引物3'端不能选择A，最好选择T。引物3'端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异，当末位的碱基为A时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为T时，错配的引发效率大大降低，G、C错配的引发效率介于A、T之间，所以3'端最好选择T。
引物3' 端要避开密码子的第3位。如扩增编码区域，引物3'端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。
不能有GC长链（连续多于两个）。GC长链有可能与模板链上的GC密集区错配，引发错误的反应。
碱基排列，应该防止两个引物3’间的配对，防止生成二聚体，同时应该防止5’与3’配对，防止生成发夹结构。
4．引物∆G值
ΔG值（自由能）反应了引物与模板结合的强弱程度。一般情况下，引物的ΔG值最好呈正弦曲线形状，即3’端ΔG值较低，而5’端和中间ΔG值相对较高，因为从5’进行的反应更方便。3'端的ΔG值相对要低，但不可过高，引物的3’端的ΔG值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应。
5．引物碱基序列
首先，两个引物或者单个引物，尽量不出现互补片段。尽量不出现连续的碱基序列，防止错误结合。
此外，还需要使用BLAST软件进行检测，防止引物与模板链的其他位置结合。
一般的，有许多相关的软件或者网页可以进行辅助设计，比如NCBI中的Primer-Blast或者Oligo软件。以Primer-Blast为例，里面可以自定义引物的起点终点，包含内含子外显子的引物设计，自动BLAST检测，还可以输入自己设计的引物去分析。
1．引物的长度
引物越长，特异性越好，但是更难与模板链结合，因此更难反应，扩增效率更低。此外，引物的长度还由DNA复制酶决定，并且与退火温度有关
一般的，引物长度为18-30bp；
2．GC含量
Tm值（melting temperature）是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度。Tm值与GC值相互联系，引物的熔化温度（Tm）介于 65°C 和 75°C 之间，当Tm值为72℃时，复性条件最佳。，对应的，目标 GC 含量在 40% 至 60% 之间。
对于上下游引物，两种引物之间应该CG含量与Tm值相差不大。若差别较大，可以添加额外的AT在DNA聚合酶不作用的引物5’端。
3．引物末端（3’）的设计
引物3'端不能选择A，最好选择T。引物3'端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异，当末位的碱基为A时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为T时，错配的引发效率大大降低，G、C错配的引发效率介于A、T之间，所以3'端最好选择T。
引物3' 端要避开密码子的第3位。如扩增编码区域，引物3'端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。
不能有GC长链（连续多于两个）。GC长链有可能与模板链上的GC密集区错配，引发错误的反应。
碱基排列，应该防止两个引物3’间的配对，防止生成二聚体，同时应该防止5’与3’配对，防止生成发夹结构。
4．引物∆G值
ΔG值（自由能）反应了引物与模板结合的强弱程度。一般情况下，引物的ΔG值最好呈正弦曲线形状，即3’端ΔG值较低，而5’端和中间ΔG值相对较高，因为从5’进行的反应更方便。3'端的ΔG值相对要低，但不可过高，引物的3’端的ΔG值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应。
5．引物碱基序列
首先，两个引物或者单个引物，尽量不出现互补片段。尽量不出现连续的碱基序列，防止错误结合。
此外，还需要使用BLAST软件进行检测，防止引物与模板链的其他位置结合。
一般的，有许多相关的软件或者网页可以进行辅助设计，比如NCBI中的Primer-Blast或者Oligo软件。以Primer-Blast为例，里面可以自定义引物的起点终点，包含内含子外显子的引物设计，自动BLAST检测，还可以输入自己设计的引物去分析。
