杂交瘤细胞培养方法步骤详解

杂交瘤细胞（hybridoma）是一种在制备单克隆抗体过程中，用骨髓瘤细胞和B淋巴细胞融合而成的细胞。杂交瘤细胞一般通过瘤细胞培养来制备。杂交瘤技术是指两个或两个以上细胞合并形成一个细胞的现象。他可使两个不同来源的细胞核在同一细胞中表达功能。
 
杂交瘤细胞培养方法：
 
1） 瘤细胞培养（无特殊要求）
 
2）免疫小鼠和脾细胞的制备
 
3）饲细胞的制备：常用小鼠胸腺细胞或小鼠的腹腔细胞
 
4）细胞融合
 
融合方法一：
1．将 1ml 40%的 PEG 液一滴滴加入到细胞团中，在 60 秒内加完，同时并不断轻微转动离 心管或用手指轻弹离心管。
2．在不断转动离心管中加 1ml 无血清培养液，60 秒钟内加完。
3．于 5 分钟内慢慢加完 20ml 无血清培养基。此时细胞对机械损伤非常敏感。
4．离心（800 转/分，8 分钟） ，去上清，用完全培养液 10ml 悬浮，轻轻混匀。
5．取 96 孔板，每孔加 50 微升。
6．取等体积细胞悬液，向另一 96 孔板中加 50 微升。
7．送入 5%CO2 温箱中 37℃培养，24 小时后更换成 HAT 选择性培养液。
 
融合方法二：
1．加 0.2ml 43%的 PEG 于离心管中。
2．用预先消毒的细玻璃针伸入管中轻轻搅动细胞团。
3．室温中置 2 分钟。
4．加入 10ml 完全培养液。
5．800 转/分离心 5 分钟。
6． 2 倍 HAT 培养液培养悬浮细胞， 24 孔板， 用 取 每孔中加 0.5ml， 96 孔板每孔中加 0.1ml。 另 7．5%CO2 温箱，37℃，一周后第一次更换培养液，培养板中预先接种有饲养细胞，加 2× HAT 选择培养液与原等量培养液混合后，即成为 1×的 HAT 培养基。
 
5）融合后细胞培养
 
6）抗体的检测
 
常用方法：免疫荧光试验、放射免疫试验（RIA） ，酶联免疫吸附试验（ELISA）等。
 
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