外泌体的功能、应用热点及分离纯化方法
一、我是谁？
外泌体是由所有细胞释放的一类胞外囊泡，比细胞小很多，大小范围为40—150nm。与细胞类似，外泌体由脂质双分子层膜构成，膜上含有各种标志性蛋白，可用于外泌体的鉴定和分离。内含物中包含特定蛋白质、RNA（mRNA、miRNA、IncRNA等）和DNA，其中miRNA的占比最多。外泌体除了存在于血浆、血清、尿液、脑脊液等人体体液中，还存在各种组织中，可以说外泌体在人体中无处不在。
图1 外泌体的组成
二、我的功能有哪些？
外泌体的功能取决于它们与受体细胞相互作用的能力，并将它们的蛋白质、脂质和核酸传递到这些细胞。与靶细胞结合的特异性取决于粘附分子，如整合素。外泌体参与多种功能如调节基因转录翻译、细胞增殖与凋亡、转移与侵袭、血管生产、免疫应答、细胞分化、代谢调控、病毒免疫-------功能决定应用，外泌体的应用主要在疾病治疗、生物标志物、药物递送等三大领域。
图2 外泌体的功能
三、我的应用热点有哪些？
图3 外泌体的发展历程
自从2013年外泌体领域科学家获得诺贝尔生理或医学奖，外泌体研究热度高居不下。2019年外泌体基础性研究经费超过2亿，大量高质量文章涌现。其中在临床癌症研究中，一篇发表于2021年的文章表明外泌体PKM能传递NSCLC4疗耐药性，缺氧诱导下顺铂耐药肺癌细胞通过外泌体PKM2向敏感细胞传递耐药性。在体外诊断应用中，有研究表明外泌体能够作为肿瘤诊断和分类的可靠标志物，可为不同类型的肿瘤的早期检测提供新视角。在心血管疾病应用中，移植的心肌球来源的细胞（CDCs）分泌可使细胞恢复年轻的外泌体，年轻的CDCs通过调节心脏基因表达、心脏功能、运动能力等方面使年老动物恢复青春。那么在免疫学研究中，有研究报道指出：多发性硬化（MS）患者中的循环外泌体可通过let-7i靶向生长因子1受体（IGF1R）和转化生长因子β1（TGFBR1）等来抑制Treg细胞，从而调节MS的发病机理。同时由于外泌体极好的生物相容性及具有保护性的脂质双分子层囊泡，所以外泌体又被广泛应用于药物递送载体领域。
图4 外泌体应用领域
图5 外泌体在癌症中的应用
图6 外泌体在心血管疾病中的应用
图7 外泌体在免疫学中应用
四、我的研究方案是什么？
图8 外泌体研究思路
谈到外泌体的研究，就不得不提到外泌体的纯化，外泌体分离纯化方法主要有以下几种：
1）超速离心法：具有不同密度和尺寸的颗粒在离心力作用下表现出不同的沉积速度。是目前外泌体分离纯化的“金标准”。2）密度梯度离心：在介质中离心后试管中的物体可以保持在密度相似的介质位置。
3）超滤法：采用具有不同分子量截止点的超滤膜来选择性分离样品，在外泌体研究中经常辅助分离。
4）尺寸排除色谱：加入多孔材料后物质按其粒径洗脱，大颗粒洗脱较早。
5）沉淀法：操作简单、快捷，外泌体回收率较高。
6）免疫捕获法：基于外泌体标记物和固定化抗体（配体）之间的特异性结合。
7）亲和离心柱：外泌体与膜亲和结合，利用洗脱液洗脱。
那么对于提取的外泌体，如何评价它的提取质量呢？目前业界主要通过以下方法来评价外泌体的质量：
1）Western Blot检测特异性囊泡（如CD81、CD63）2）NTA检测囊泡粒径分布。
对于外泌体的内含物核酸研究，主要是通过qPCR或者NGS测序来进行研究。
