脑脊液的蛋白质组分析揭示了帕金森病的候选生物标志物
帕金森病（PD）是第二常见的神经退行性疾病，在世界范围内日益增长，影响着全世界数百万人，并且随着年龄的增长发病率显着增加。但迄今为止，在临床上还没有可靠的生物标志物。2022年6月Matthias Mann及Sebastian Virreira Winter等团队在Cell Reports Medicine上发表名为“Proteome profiling of cerebrospinal fluid reveals biomarker candidates for Parkinson’s disease”的文章，使用脑脊液蛋白质组分析以发现帕金森病的候选生物标志物。在文章中，研究者描述了一个可扩展和灵敏的基于质谱(MS)的蛋白质组学工作流程，用于脑脊液蛋白质组分析。研究者从脑脊液中重复量化了超过1700个蛋白质。使用机器学习筛选出了PD患者中OMD、CD44、VGF、PRL和MAN2B1的改变以及与临床评分显著相关。研究者还发现在LRRK2、G2019S携带者中存在神经炎症的特征。最后与研究者之前获得的尿液蛋白质组的数据比较发现了PD相关变化（包括溶酶体蛋白）有大量重叠，这为提高PD发病机制的理解开辟了新途径。
影响因子：16.988
组学技术：DIA蛋白质
实验样本：215个脑脊液样本RESRUIT
实验结果
用于脑脊液蛋白质组分析的PD队列概述
为了研究帕金森病如何影响患者的脑脊液并识别潜在的生物标志物，我们采用了“矩形”生物标志物发现策略。研究者分析了来自两个独立队列共215个个体的脑脊液样本，包括113名健康对照（HC）和102名PD患者（第一个队列称HBS队列、第二个队列称LCC队列）。
脑脊液样品的蛋白质组学特征
研究者开发了一个稳健、自动化和高通量的基于质谱的蛋白质组学工作流程，使用数据独立采集（DIA）策略进行蛋白质组分析（图 1A）。该策略先前已取得了前所未有的深度，并揭示了多个独立的阿尔茨海默病队列中具有生物学意义的蛋白质组变化。研究者应用他们自己的工作流程，探究无论患者是否存在LRRK2中与疾病相关的G2019S突变。为了最大限度提高蛋白质检测的深度和覆盖率，研究者通过合并三个库生成了特定于队列的混合光谱库（图1B）。在超过70%的样本中分别量化了1290个（HBS）和1440个（LCC）蛋白质组（图1C、D）。量化的蛋白质强度跨越了四个数量级（图1E、1F）。仅前10个最丰富的蛋白质就贡献了约38%的总CSF蛋白质组信号，说明了分析的挑战（图1E和1F）。
根据人类蛋白图谱（HPA）注释，研究者进一步将已鉴定的蛋白分类为细胞、细胞内或细胞膜分泌的蛋白质（许多蛋白质被多次分配）。总的来说，94%的已鉴定蛋白至少携带一个注释，其中36%为分泌蛋白，70%为细胞内蛋白，36%为跨膜蛋白。此外，大多数定量蛋白被注释为在大脑和肝脏中富集，这与脑脊液是中枢神经系统的细胞外液的事实相一致。综上所述，通过使用较小的脑脊液体积，我们单次分析获得了非常高的脑脊液蛋白质组覆盖率，从而为发现PD中的生物标志物提供基础。
图 1
定量精度和样品质量的评估
研究者为了评估数据的定量精度，通过重复测量合并的脑脊液样本，研究自动化工作流程的内部和分析间的变异性。分析显示，13%的内部板块变异系数和19%的板块间变异系数（CV）的高技术重现性。大约1100人的检测间和检测内CV低于20%，1500人低于50%（图1G）。受试者之间的个体间生物变异性要大得多，所有蛋白质中只有10%的CV低于20%（图1G）。这表明检测方法的技术变异性比生物学变异性小得多，这是成功发现CSF中PD特异性蛋白质组特征和潜在生物标记物的重要前提条件。
不一致的样本收集和处理可能会导致系统性偏差并阻碍真正的生物标记物的发现。为了确保脑脊液蛋白的定量变化是由于疾病相关的病理改变，研究者根据先前建立的凝固相关蛋白、血小板和红细胞的质量标记模型来评估所有样本的质量，以确定在分析前处理中是否存在潜在问题的样本（图2A、2B）。
结果表明：红细胞特异性标记的污染程度在样本间有很高的变异性，可能是由于与血液穿刺相关的污染（图2A、2B）。研究者从HBS队列中标记了14个样本（8个PD, 6个HC），从LCC队列中标记了17个样本（4个PD, 13个HC）的红细胞污染，并将其从进一步分析中删除（图2C和2D）。共有182个受试者的蛋白质组数据符合质量标准并被用于统计分析。研究者发现红细胞计数和脑脊液中红细胞特异性蛋白的数量之间没有相关性（图2E）。
研究者还进一步排除了来自 HBS队列的单个样本，该样本在主成分分析（PCA）中远离其他样本聚集，而LCC队列中的单个样本在蛋白质组深度上是异常值。我们随后通过生物信息学分析来自 HBS队列的 79 个样本和来自 LCC 队列的 103 个样本，以确定疾病表现和 LRRK2 突变状态对 CSF 蛋白质组的影响。
PD患者脑脊液和基于机械学习的对照组分类中PD相关蛋白质组改变
为了研究PD患者与对照组相比脑脊液蛋白质组的改变，研究者进行了ANCOVA分析，将年龄、性别和 LRRK2 突变状态视为混杂因素。在5%的错误发现率（FDR）下，与HBS对照组相比，在HBS队列PD患者的脑脊液中发现了三种显著调控蛋白（CPM、OMD和RFNG）；与LCC对照组相比，在LCC队列PD患者中发现了一种（PRCP）（图3A）。
PD患者的骨调节蛋白（OMD）和细胞表面标记蛋白（CD44）蛋白水平均显著升高（图3B-3E）。随后研究者进行了GO富集分析。结果表明：与对照组相比，PD样品中升高的蛋白质在溶酶体相关功能上富集（图3F）。
由于在两组人群中都存在（但数量很少）共同改变的蛋白质，研究者使用最近引入的开源工具OmicLearn测试了机器学习（ML）如何区分PD患者和对照组。在每次训练迭代中选择35个最具识别力的用于训练模型的蛋白质，分类器根据它们的特征重要性对它们进行排序（图3G）。其中催乳素是50次训练迭代中最重要的特征。当使用这些特征来训练XGBoost时并基于集成树的模型和交叉验证方案，ROC曲线的平均曲线下面积（AUC）为0.72±0.08。
AUC是分类模型性能的常用度量，范围包括0（所有预测都是错误的）到1（所有预测都是正确的）。敏感性（即正确分类PD患者的比率）和特异性（即正确分类PD阴性个体的比率）分别为67%和66%（图3H）。综上所述，研究者的CSF蛋白质组数据与ML算法相结合，可以对疾病状态进行分类。更重要的是确定了几种有前景的PD相关蛋白，为未来的研究开辟了新的线索。
图 3
致病性LRRK2 G2019S突变对脑脊液蛋白组的影响
由于LCC队列中有大量携带LRRK2 G2019S突变的受试者，研究者探索了LRRK2突变状态是否会改变脑脊液蛋白质组。我们再次采用性别、样本收集年龄、研究中心和PD状态作为混杂因素。在FDR为5%时，突变显著改变了HLADRA、HLA-DRB1、HLA-DPA1、CTSS、PLD4、TKT、ITGB2、PRDX3、ITIH5、CNDP1和FAH蛋白的丰度（图4A）。根据样品中鉴定的肽段，我们可以区分两种HLA-DRB1蛋白，这两种蛋白都在LRRK2 G0219S载体中显著富集。此外，FDR为5%的T检验直观地证实了突变携带者中HLA-DRA、HLA-DRB1和HLA-DPA1的上调（图4a和4B）。这些 HLA 蛋白以及 PLD4 和 CTSS 在在 PD 患者中显着升高（>1.7倍；图 4B-4D）。在整体范围内使用这种方法观察到与野生型(WT)等位基因携带者相比，LRRK2 G2019S携带者的CSF蛋白质组中升高的蛋白质富含与免疫和炎症反应相关的类别，进一步支持了炎症反应增强与PD之间密切关联的实质性证据(图4E)。
此外，对健康个体的非表现性LRRK2携带者（NMCs）的分析也显示出在致病性LRRK2携带者中，一些HLA分子CTSS以及ADAM10和FAM234A（ITFG3）表达上调，其中HLA-DRB1是唯一在FDR为5%时鉴定到显著性水平的蛋白。与健康个体相比，致病性LRRK2携带者发生PD的可能性更高；因此，该分析中鉴定的蛋白质可能包括预后因素。研究者最近在两个独立队列中发现，多个组织蛋白酶家族包括组织蛋白酶A、B、C、D、H、L、O、S和Z的水平在LRRK2 G2019S携带者的尿液中显著增加。研究者也在脑脊液中检测到这些组织蛋白酶，但与尿液相比，只有组织蛋白酶S（CTSS）受突变状态的显著影响（图4F）。
图 4
脑脊液和尿液蛋白质组的整合
研究者在其之前的研究中分析了来自两个独立的横向队列（Columbia和LCC）的235个尿液样本，包括两种类型的对照组、健康人群、LRRK2 G2019S携带者、LRRK2 G2019S突变和无LRRK2 G2019S突变的PD患者，共量化了2365个尿蛋白。随后研究者整合了尿液和脑脊液蛋白质组来确定共同调节的蛋白。
结果显示：超过1000个重叠蛋白质，相当于两种生物流体中所有已识别蛋白质的36%（图5A）。匹配共同的蛋白质丰度揭示了两种生物液体之间的明确相关性（图5 B）。两种液体中最丰富的蛋白包括ALB，PTGDS，ORM1，SERPINA1，B2M，以及几种载脂蛋白和免疫球蛋白（图5B）。
此外，Fischer对与尿液或脑脊液中特异性发现的蛋白质或其共同重叠相关的GO术语的精确测试与两种体液中鉴定的所有蛋白质相比显著丰富（图5C）。
与对照组相比，将PD患者CSF（HBS和LCC）和尿液（Columbia）中量化的所有常见蛋白质的ANCOVA q值与对照相关，表明两种液体中的几种蛋白质受到调节（图5D-E）。
其中包括骨调节蛋白（OMD），其水平在PD患者的尿液中也显著升高，平均倍数变化为1.47（图5F）。接下来，研究者将LCC队列的CSF样本和Columbia或LCC队列的尿液样本中定量的所有常见蛋白的LRRK2 G2019S与LRRK2 WT进行整合（图5G和5H）。结果显示，在两种基质中以LRRK2状态依赖性方式调节组织蛋白酶S（图5G-H）。
与LRRK2 WT携带者相比，LRRK2 G2019S携带者CSF中的组织蛋白酶S水平更高，Columbia和LCC队列的平均倍数变化分别为1.31（p值为0.0619）和1.65（p值为0.0001574）（图5I）。
图 5
脑脊液蛋白质组与指示疾病严重程度的临床评分的相关性
接下来，研究者研究了HBS队列中的蛋白质水平变化是否与统一帕金森病评定量表（UPDRS）评估的PD病理学严重程度相关（图6）。研究者发现，在特发性PD患者中，有27个蛋白与UPDRS评分显著相关（p < 0.001；图6A）。
PD患者中最高正相关的蛋白包括CHST6（=1.6E-5和皮尔逊相关性= 0.72）、MIF（=1.8E-5和= 0.67）、LYVE1（=4.8E-5和= 0.64）、EFNA1（=5E-5和= 0.64）和ADM（=1.3E-4和= 0.61；图6A）。PD患者中最负相关的蛋白包括POMGNT1（p = 4.6E-5和=0.64）、TMEM132A（p = 5.7E-5和=0.63）、ADAM22（p = 8.8E-5和=0.62）、PAM（p = 1.9E-4和r=0.6）和ST6GAL2（p = 2.7E-5和=0.59；Figure 6A）。有趣的是，与对照组相比，这些蛋白质在PD病例中没有显著改变。然而，ADM是与简易精神状态检查（MMSE）评分（p=9.3E-5；r=-0.43；认知障碍的定量测量）负相关最强的蛋白。值得注意的是，在样本采集时没有人出现严重痴呆或认知障碍（PD平均得分28.3，对照组平均得分28.4）。
此外，研究者还将脑脊液蛋白的相关性评分与之前在尿液中获得的研究结果进行了比较。UPDRS III评分（尿液唯一可用评分）的皮尔逊系数比较显示:10种蛋白质（APOF、MAN2B2、LYVE1、APLP1、ALDOA、IGF2、SUSD5、CD99、S100A7和VGF）的系数均高于0.4或低于0.4（图6B）。其中，VGF与两个数据集中的UPDRS III评分呈显著负相关（尿液和脑脊液中的分别为p=2.8E-3和7.6E-3；图6C）。总之，该分析表明通过运动功能评估的PD患者的疾病进展会影响CSF和尿液中的一组类似蛋白质。
在LCC队列中，可以获得所有受试者的蒙特利尔认知评估（MoCA）分数。有趣的是，研究者发现CHIT1与所有患者的MoCA评分显负相关（在所有受试者中p=1.6E-5和r=0.48；图S5D），而这种相关性在PD患者中更显著（在PD患者中p=1.9E-9和r=0.81；图S5E）。在脑脊液中，与MoCA评分呈强正相关的两个蛋白，RELN和PENK，与年龄呈负相关。因此，脑脊液蛋白质组中的多种蛋白质与疾病的严重程度和疾病的不同临床重要方面密切相关。
文章小结
研究者应用了一个高度可复制、可扩展的基于MS的蛋白质组学工作流程来对PD患者的脑脊液进行蛋白质组分析。相比于对照组，在PD患者中可以显著观察到蛋白质组的变化，并确定了LRRK2、G2019S携带者特异性的生物标志物。当然研究者还需要分析更大的患者队列进行进一步的研究，去发现更多潜在的生物标志物。接下来研究者需要开发临床和靶向分析来验证生物标志物，然后在临床常规中使用一种测试，以实现早期疾病检测和患者分层。
