哈佛医学院发表纳米生物技术助力蛋白质组的全面表征和深度覆盖研究
前言
2022年11月Ferdosi Shadi发表了题为“Enhanced Competition at the Nano-Bio Interface Enables Comprehensive Characterization of Protein Corona Dynamics and Deep Coverage of Proteomes”的研究成果，作者将工程化纳米颗粒（nanoparticles，NPs）引入到血液等生物流体中，在蛋白质-NP亲和力和蛋白质丰度之间的关系驱动下，在颗粒-蛋白质界面形成选择性和可重复的蛋白质冠。这使得利用蛋白质-纳米相互作用的可扩展系统能够克服目前深度血浆蛋白质组学在大型队列中的局限性。
研究思路
研究结果
1.纳米颗粒工程与蛋白质电晕研究
为了研究纳米生物的相互作用和NP电晕的形成动力学，作者设计、表征和比较了不同的NP，并进行了自动化的高通量深度蛋白质组分析工作流程（图1A）。为了表征这些NPs的理化性质，并确保成功合成图1B-D所示的所有5种目标SPIONs，进行了振动样品磁力测量（VSM）、透射电子显微镜（TEM）、X射线光电子能谱（XPS）、动态光散射（DLS）和ZETA电位测量，结果表明本研究中使用的NPs的具有独特特征。
图1 | NP蛋白质组学工作流程和表征
2.调控纳米生物的相互作用
为了研究蛋白冠组成、NPs的理化性质、可利用的结合表面和蛋白结合竞争之间的关系，作者定量剖析了在不同血浆-NP（P/NP）比率下形成的蛋白冠（图2A）。在这个实验中，使用Proteograph Product Suite对蛋白质冠状结构进行了全自动分离和处理。
通过捕获离子迁移的LC-MS/MS管道（timsTOF-Pro）对肽段进行鉴定和定量，并使用DIA-NN在蛋白质和肽段的水平上应用1%[xss_clean_space]FDR截断值对原始数据进行处理，最终在所研究的5个NPs中产生2081个蛋白质和14194个肽段（1918个蛋白和12747肽段分别在至少一个测试条件的所有重复中被一致识别）。
图2 | Vroman效应和NP蛋白质组学性能
3.复杂生物样品中纳米生物相互作用的定量解析
为了测试蛋白质识别性能的提高是否能转化为对临床相关蛋白质的更好检测，作者调查了生物途径的覆盖率，结果证明随着P/NP比率的增加，细胞因子/化学因子和激素信号蛋白在面板水平上的覆盖率有所提高（跨越所有5种NPs，图3）。
为了估计用NPs对低丰度血浆蛋白质组进行可重复和大规模访问的效用，作者从丰度高的500个蛋白质(图3D)中的生物标志物频率外推预测生物标志物发现潜力。
从这个分析中，估计在接下来的1500个低丰度蛋白中可以发现大约200个额外的蛋白生物标志物，这比迄今为止在这个数据集中注释的生物标志物的数量多了一倍以上。
4. NP-电晕动力学建模
为了深入了解电晕形成的动态，作者扩大了NP-C、NP-D和NP-E颗粒的NP电晕分析，并增加了每个P/NP比例的蛋白质电晕形成时间过程数据（10分钟、30分钟、1、2、17小时，图4A），测量了534个样品中3184个单独蛋白质组的强度，并使用UMAP方法来概述每个条件下电晕蛋白强度分布的差异和相似性（图4B），结果证实了Proteograph工作流程的可重复性和在所有探测的实验条件下蛋白质电晕形成的精确度。
通过使用UMAP系统地比较所有蛋白质的强度谱，不同NPs的强度图谱所占据的UMAP区域大体上是重叠的，这表明虽然NPs与特定蛋白质具有结合特异性，但它们在整个蛋白质组的相互作用的动态是由共同的机制决定的。
总的来说，在指定的检测条件下，NP电晕的定量重现性非常高，除了NP功能化外，在P/NP和孵化时间方面也有广泛的调整机会。
图4 | P/NP比例和NP孵化时间的调制对蛋白质电晕的影响
研究结论
当暴露在生物基质中时，工程化的纳米颗粒形成高度可重复的蛋白质冠，可用于高动态范围蛋白质组的深度和定量研究以及广泛的医学应用。所形成的纳米生物复合物的理化性质和生物活性是NP表面设计的函数，正如文章显示的那样，在很大程度上取决于生物样本相对于结合表面积的分子组成和浓度。
由于纳米粒在体内应用的浓度机制与本研究中考察的条件相似，因此除了纳米粒的功能化外，纳米粒的给药方式、患者的蛋白质组组成和循环时间也会影响纳米粒的冠层组成、药代动力学和动力学。
因此，纳米工程，基于全面无偏质谱的电晕成分动力学读出和机器学习的独特结合提供了：1、通向深度和可扩展的血浆蛋白质组学的门户；2、更好地预测体内电晕形成和生物分布的新策略。
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本研究通过不同类型的功能化NPs相对于复杂生物样品的特定结合表面积，以及在蛋白质冠层形成的时间过程研究中，询问蛋白质的结合和蛋白质冠层的组成。
证明了通过限制NP的表面积来调整Vroman效应，可以显著改变电晕组成并增强下游蛋白质组学分析性能，与传统的血浆蛋白质组学工作流程相比，单个NP的血浆蛋白质组覆盖率提高了3倍。
鹿明生物Deep高深度血液蛋白质组
鹿明生物基于纳米颗粒对血液样本中低丰度蛋白进行富集，采用全新一代4D tims TOF Pro2结合DIA- PASEF质谱扫描模式对血液中低丰度蛋白进行无遗漏的全景式扫描采集，全面提升中低丰度蛋白的检出率，实现血液样本2000+的高深度检测。基于最权威的SwissProt reviewed非冗余数据库+Spectronaut Pulsar 16分析软件进行搜库定性定量分析获得高质量的定性定量结果，部分测试数据如下：
血清高丰度去除与低丰度富集处理蛋白鉴定数对比
另外，纳米颗粒吸附不同于免疫亲和法，对一些没有商业化试剂盒无法有效进行高丰度去除的物种样本也表现出良好的处理效果，可以摆脱去除高丰度蛋白试剂盒对物种的限制，以下为部分项目经验展示（如下图）。
