94份玉米中6类真菌毒素检测及污染情况分析详解

      摘要：建立了玉米的一步法提取6类真菌毒素同时检测的分析方法，共分析了96份玉米中6类真菌毒素的污染情况及地域分布情况，为监测饲料质量提供技术指导。称取的样品添加6类真菌毒素同位素内标，以84%乙腈水和50%甲醇水作为提取试剂，以2mM乙酸铵0.1%甲酸水溶液和甲醇/乙腈和水为流动相梯度洗脱，采用液相色谱-串联质谱进行检测。94份玉米中6类真菌毒素的检出率为98%，单种毒素检出率最高的是伏马毒素B1和B2，高达88%，呕吐毒素和赭曲霉毒素A检出率最低，均未检出。伏马毒素B1和B2、黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮和呕吐毒素的最高残留量分别是89.1mg/kg、76.4ug/kg、3.95×103mg/kg和7.0mg/kg。地域分布上具有分布范围广，污染较严重的特点。建立的6类真菌毒素检测方法操作简单、结果准确，结果分析对玉米中真菌毒素污染检测和防控具有重要意义。
关键词：真菌毒素、液相色谱--串联质谱、污染情况、真菌毒素同位素内标
 
  真菌毒素属于真菌的代谢产物，几乎可以污染所有的农作物，会损害动物体的肝脏、肾脏及皮肤组织等，进而通过食物链的形式影响到人体的健康。[1]已知的真菌毒素多达300种以上，目前多个国家均建立了饲料中真菌毒素的限量要求，[2-3]我国已于2017年推出国家强制性标准GB 13078-2017饲料卫生标准，并于2018年实施，其对黄曲霉毒素B1、呕吐毒素、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素A、伏马毒素B1和B2、T-2毒素等做出明确的检测方法规定和限量要求。本文采用94份玉米为样本，对这6类真菌毒素进行检测方法开发和污染情况分析。为多毒素的快速检测提供技术支持的同时，也为饲料中真菌毒素污染的监测和防控提供帮助。本文采用液相色谱-串联质谱，通过加入同位素内标进行校正的手段，开发6类真菌毒素的检测方法，并对94份玉米样品进行6类真菌毒素的检测及污染情况分析。
 
1.材料
 
1.1仪器 TSQ Quantis液相色谱-串联质谱、KS-7200DE超声波提取仪和TGL-16M高速冷冻离心机
 
1.2试剂 真菌毒素标准品：黄曲霉毒素B1、呕吐毒素、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素A、伏马毒素B1和B2和T-2毒素
 
真菌毒素同位素内标：黄曲霉毒素B1同位素内标、呕吐毒素同位素内标、玉米赤霉烯酮同位素内标、赭曲霉毒素A同位素内标、伏马毒素B1同位素内标、伏马毒素B2同位素内标和T-2毒素同位素内标
 
1.3样品 
96份玉米种类及地域分布（样品来源于全国近30个省份及地区）
 
96份玉米种类涉及青农1801、郑单958、万盛189、登海W189、洛玉16、中选777等。依据我国区域划分方式将94份玉米的分布区域进行汇总统计

区域	省份	份数
华东地区	山东、江苏、安徽、浙江、福建、上海	22
华南地区	广东、广西、海南	10
华中地区	湖南、湖北、河南、江西	12
华北地区	北京、天津、河北、山西、内蒙古	17
西南地区	四川、云南、西藏、重庆	12
西北地区	宁夏、新疆、青海、陕西、甘肃	10
东北地区	黑龙江、吉林、辽宁	11

2.方法
2.1色谱及质谱条件：
色谱柱： Hypersil GOLD C18 （100*2.1 3um）
流动相： 2mM乙酸铵0.1%甲酸水溶液和甲醇梯度洗脱伏马毒素B1和B2、黄曲霉毒素B1、赭曲霉毒素A和T-2毒素/乙腈水梯度洗脱呕吐毒素和玉米赤霉烯酮
梯度表1

时间	流速mL/min	2mM乙酸铵0.1%甲酸水	甲醇
0	0.3	70	30
1	0.3	70	30
3.5	0.3	30	70
4	0.3	30	70
5	0.3	5	95
9	0.3	5	95
10	0.3	70	30

梯度表2

时间	流速mL/min	水	乙腈
0	0.3	70	30
1	0.3	70	30
3.5	0.3	30	70
4	0.3	30	70
5	0.3	5	95
9	0.3	5	95
10	0.3	30	70

 
采用ESI离子源，分别用正离子模式扫描和负离子模式扫描，多反应监测模式（MRM）采集数据，6类真菌毒素及其对应同位素内标的质谱参数见下表：
 
6类真菌毒素及其对应同位素内标的质谱参数

毒素名称	母离子m/z	子离子m/z	碰撞电压/V	射频透镜 电压/V	采集模式
FB1	722.3	334/352	40/36	279	[M+H]+
13C-FB1	756	356/373/374/737	39/34/35/26	180	[M+H]+
FB2	706.35	318/336	35/39	243	[M+H]+
13C-FB2	740.7	340/358/376/723	40/38/34/28	216	[M+H]+
AFB1	313.1	241/269/285	38/32/23	176	[M+H]+
13C-AFB1	330	255/284/301	39.7/32.8/24.1	181	[M+H]+
OTA	404.088	193/221/239/241/358	43/37/24/20/15	143	[M+H]+
13C-OTA	424	250/377	27/14	140	[M+H]+
T-2	484.21	185/215/305	22/19/13	109	[M+NH4]+

 

毒素名称	母离子m/z	子离子m/z	碰撞电压/V	射频透镜电压/V	采集模式
13C-T-2	508.4	198/229/322	22/19/14	121	[M+NH4]+
DON	295	138/265	17/12	109	[M-H]-
13C-DON	310	145/279	14/12	109	[M-H]-
ZON	317	131/175/273	30/24/19	170	[M-H]-
13C-ZON	335	140/185/290	31/25/19	178	[M-H]-

 
注：FB1为伏马毒素B1简写（下同），FB2为伏马毒素B2简写，AFB1为黄曲霉毒素B1简写，OTA为赭曲霉毒素A简写，T-2位T-2毒素简写，DON为呕吐毒素简写，ZON为玉米赤霉烯酮简写；13C为其相应的同位素内标简写
 
2.2标准品的配制 
 
2.2.1混合标准品配制：配制伏马毒素B1和B2浓度为2.4ppm、黄曲霉毒素B1浓度为80ppb、玉米赤霉烯酮1.6ppm、呕吐毒素3.2ppm、T-2毒素1.6ppm、OTA160ppb的混标
 
2.2.2同位素内标配制：配制伏马毒素B1和B2浓度为240ppb、黄曲霉毒素B1浓度为8ppb、玉米赤霉烯酮160ppb、呕吐毒素320ppb、T-2毒素160ppb、OTA16ppb的同位素内标混合标准品
 
2.3样品处理
 
称取5g样品各两份，加入同位素内标100uL，其中一份加入20mL84%乙腈水，另一份加入20mL50%甲醇水，超声波震荡提取20min，6000r/min离心5min，上清液过0.22um有机滤膜，液相色谱-串联质谱检测。
 
3.结果分析
3.1谱图 3.2回收率

项目	FB1	FB2	AFB1	ZON	DON	T-2	OTA
添加水平	600ng/g	600ng/g	20ng/g	400ng/g	800ng/g	400ng/g	40ng/g
回收率	83.6%	80.4%	101.8%	109.8%	88.0%	91.3%	86.9%

 
3.3线性

项目	相关系数	线性范围/ng	线性方程
FB1	0.9991	0.19-100	y = 219.68x - 1206.9
FB2	0.9996	0.19-100	y = 911.45x - 1989.7
AFB1	0.9993	0.049-40	y = 61482x + 6.8125
ZON	0.9995	0.094-35	y = 8008.3x - 42517
DON	0.9999	2-450	y = 2755.5x - 796.14
T-2	0.9994	0.1-100	y = 110254x - 63112
OTA	0.9997	0.01-20	y = 1824.1x + 1.5954

 
3.4整体污染情况
 
对96份玉米的6类真菌毒素检测结果进行分析汇总，所有样品均未检出赭曲霉毒素和T-2毒素。96份玉米中有2份玉米不含有这6类真菌毒素，10份玉米只含有1类真菌毒素，32份玉米含有2类真菌毒素，44份玉米含有3类真菌毒素，6份玉米含有4类真菌毒素。
 
污染情况占比图  
 
3.5区域分布情况
 
依据94份样品分布区域进行划分，对6种真菌毒素进行分析汇总（汇总表见下），西北地区玉米受真菌毒素污染的种类最少，污染程度最低；华中地区、华北地区、西南地区和东北地区毒素污染情况较重；华东地区和华南地区玉米受真菌毒素污染的种类和程度最高。
 

毒素种类	华东	华南	华中	华北	西南	西北	东北	总计
0	0	0	0	0	0	2	0	2
1	2	0	0	1	1	5	1	10
2	6	2	6	7	4	1	6	32
3	13	5	6	9	5	2	4	44
4	1	3	0	0	2	0	0	6
5	0	0	0	0	0	0	0	0
6	0	0	0	0	0	0	0	0
总计	22	10	12	17	12	10	11	94

 
3.6超限情况
3.6.1
对96份玉米的6类真菌毒素检测结果进行分析汇总，依据GB 13078-2017 饲料卫生标准限量要求进行超限判断（表1），超限样品共计14份，其中9份样品一类真菌毒素超限，剩余5份样品两类真菌毒素超限。针对赭曲霉毒素和T-2毒素含量，所有样品均合格；此外，其余毒素超限情况如下：伏马毒素B1+B2、黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、呕吐毒素的超限样品份数分别为：3份、2份、11份和3份，其对应的超限率分别为3.2%、2.1%、11.7%和3.2%。
 
表1 部分饲料原料中6类真菌毒素检测标准及限量要求

项目	产品名称	检测标准	限量
黄曲霉毒素B1	玉米加工产品、花生饼	NY/T 2071	≤50ug/kg
赭曲霉毒素A	谷物及其加工产品	GB/T 30957	≤100ug/kg
玉米赤霉烯酮	玉米及其加工产品	NY/T 2071	≤0.5mg/kg
呕吐毒素	植物性饲料原料	GB/T 30956	≤5mg/kg
T-2毒素	植物性饲料原料	NY/T 2071	≤0.5mg/kg
伏马毒素B1+2	玉米及其加工产品	NY/T 1970	≤60mg/kg

3.6.2
对96份玉米的6类真菌毒素检测结果进行分析汇总，依据GB 2761-2017 食品安全国家标准 食品中真菌毒素限量要求进行超限判断（表2），超限样品共计46份，其中25份样品一类真菌毒素超限，剩余21份样品两类真菌毒素超限。针对赭曲霉毒素含量，所有样品均合格；此外，其余毒素超限情况如下：黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、呕吐毒素的超限样品份数分别为：4份、35份和28份，其对应的超限率分别为4.3%、37.2%和29.8%。
 
表2 部分食品中6类真菌毒素检测标准及限量要求

项目	食品类别	检验方法	限量
黄曲霉毒素B1	玉米、玉米面及玉米制品	GB 5009.22	20ug/kg
赭曲霉毒素A	谷物及其制品	GB 5009.96	5.0ug/kg
玉米赤霉烯酮	玉米、玉米面（渣、片）	GB 5009.209	60ug/kg
呕吐毒素	玉米、玉米面（渣、片）	GB 5009.111	1000ug/kg

 
 
3.7 单类毒素分析
 
由于所有样品均未检出赭曲霉毒素和T-2毒素，故只对其余四类真菌毒素进行单独分析94份玉米中6类毒素污染情况对比图
   
3.7.1 伏马毒素B1+B2
对96份玉米的伏马毒素B1和B2检测结果进行分析汇总，有检出样品数量为88份，占比93.6%，检测结果在0.0503mg/kg-89.1mg/kg，中位值为6.41mg/kg；整体污染水平为10.9mg/kg，阳性污染水平为11.6mg/kg。
 
3.7.2 黄曲霉毒素B1
对96份玉米的黄曲霉毒素B1检测结果进行分析汇总，有检出样品数量为29份，占比30.9%，检测结果在2.20ug/kg-76.4ug/kg，中位值为4.58ug/kg；整体污染水平为3.48ug/kg，阳性污染水平为11.3ug/kg。
 
3.7.3 玉米赤霉烯酮
对96份玉米的玉米赤霉烯酮检测结果进行分析汇总，有检出样品数量为56份，占比59.6%，检测结果在10.6mg/kg-3.95×103mg/kg，中位值为98.3mg/kg；整体污染水平为329mg/kg，阳性污染水平为552mg/kg。
 
3.7.4 呕吐毒素
对96份玉米的呕吐毒素检测结果进行分析汇总，有检出样品数量为56份，占比59.6%，检测结果在0.1mg/kg-7.0mg/kg，中位值为1.0mg/kg；整体污染水平为0.8mg/kg，阳性污染水平为1.4mg/kg。
 
4讨论
目前，从技术角度讲，饲料中真菌毒素检测共涉及到6大类，检测标准4项，前处理方法不一，净化产品各异，对人员、操作、设备要求苛刻，给检测带来严峻的挑战；从污染根源分析，一种真菌可能产生多种毒素，一种原料会受到多种真菌感染，往往是单个饲料样品需要检测多种真菌毒素；从现实情况来看，饲料受真菌毒素污染情况较严重，且分布不均匀，需要加强其毒素监测。本文所述的一步法检测，采用直提的方式，同位素校正的手段，在保证结果准确的前提下，最大程度降低操作难度，缩短检测周期，同时也控制了实验成本。
综上，本文不仅为饲料中6类真菌毒素的检测提供有效的方法支撑，同时也为饲料中真菌毒素残留的检测方向提供指导，为保证饲料产品的质量提供帮助。
 
 
[1]王艳霞 饲料及原料中真菌毒素的危害、降解和检测技术研究[J].饲料研究,NO.08 2022：158.
[2]孙梅峰,豆小文,张磊,等.真菌毒素毒性及其在生物样本中检测技术研 究进展[J].中国药理学与毒理学杂志,2020,34(10):788-800.
[3]张徽,孙金旺,刘媛,等.农产品真菌毒素污染生物控制关键技术创新与 综述 NO.08 2022 160 饲料研究 FEED RESEARCH 应用[J].中国科技成果,2020(3):69-70