纳米孔测序技术在动物疫病防控领域的应用
近年来，纳米孔测序技术发展迅速，凭借其长读长、轻便易携、实时测序等技术优势，可及时准确鉴别病原体，给出精准检测结果，有助于基层有效应对突发、新发、外来动物疫情，在动物疫情现场处置、流行病学调查监测、动物疫病临床快速诊断、病原体基因组学研究等动物疫病防控领域得到广泛应用。
齐碳与大家总结分享目前基于纳米孔测序技术在动物疫病防控中的相关研究成果，为动物疫病防控领域研究提供新思路。
1、利用纳米孔测序技术对非洲猪瘟进行快速全基因组测序
▲作者:
O'Donnell VK, Grau FR, Mayr GA, Sturgill Samayoa TL, Dodd KA, Barrette RW.
▲DOI:
10.1128/JCM.01104-19
▲解读
非洲猪瘟病毒 (ASFV) 是一种严重且高度传染性的猪病毒病的病原体，由于高死亡率和对国际贸易的影响，对养猪业造成严重的经济后果。没有有效的疫苗来控制非洲猪瘟 (ASF)，因此，有效的疾病控制取决于 ASFV 的早期检测和诊断。较大ASFV 基因组(~180 kb) 阻碍了快速获得全基因组序列的能力。然而快速获取数据对于鉴定分离株和支持流行病学工作至关重要。
该研究通过长读长测序技术与开发的配套脚本（非洲猪瘟快速分析测序工具ASF-FAST) 结合使用时，可以实时分析输出数据。完整的 ASFV 基因组序列来自细胞培养分离物和实验感染猪的血液样本中产生的。从提取的核酸中去除宿主 DNA 有助于快速鉴定 ASFV 序列，在测序开始后 6 分钟内检测到 ASFV 特异性序列。无论起始材料如何，都可以在 10 分钟内获得足够的序列覆盖病毒全基因组。总体而言，该研究重点介绍了纳米孔测序技术与 ASF-FAST 软件的结合使用，目的是快速、实时地从诊断样本中分离出完整的 ASFV 基因组。
2、坦桑尼亚和加纳鸡新城疫病毒的分子特征研究 
▲作者:
da Silva AP, Aston EJ, Chiwanga GH, Birakos A, Muhairwa AP, Kayang BB, Kelly T, Zhou H, Gallardo RA.
▲DOI:
https://doi.org/10.3390/v12090916
▲解读
虽然新城疫（ND）在许多非洲国家流行，但有关流行基因型的信息仍然很少。在坦桑尼亚，报告了基因型为V型和XIII型的疫情。在西非和中非，基因型 XIV、XVII 和 XVIII 最为主要。为了研究在坦桑尼亚和加纳的其他基因型，本文作者使用纳米孔基因测序技术对来自坦桑尼亚和加纳的分离株进行了基因分型。研究人员成功地对来自坦桑尼亚的24个分离株和来自加纳的4个样本的NDV F基因高变区进行了测序。在坦桑尼亚，发现了基因型V型、VII型和XIII型。来自加纳的所有分离株都属于基因型XVIII。本研究获得的数据反映了非洲NDV的遗传多样性，并强调了监测对监测NDV基因型分布和病毒进化的重要性。
II类新城疫病毒系统发育分析
3、利用纳米孔测序对罗非鱼湖病毒(TiLV)进行快速基因分型
▲作者:
Jerome Delamare-Deboutteville, Suwimon Taengphu, Han Ming Gan, Pattanapon Kayansamruaj, Partho Pratim Debnath, Andrew Barnes, Shaun Wilkinson, Minami Kawasaki, Chadag Vishnumurthy Mohan, Saengchan Senapin, Ha Thanh Dong.
▲DOI:
https://doi.org/10.1111/jfd.13467
IMFORMATION
▲解读
传染病是可持续水产养殖生产面临的主要挑战之一。在疑似疾病病例早期对新出现的病原体进行快速、准确的诊断和基因分型，对及时响应、部署适当的控制措施并预防或减少传染病传播至关重要。目前，大多数实验室使用 PCR 来扩增病原体的基因组区域，并结合使用传统 的Sanger 测序以辅助验证。但这种方法主要的缺点是检测周期长。
罗非鱼湖病毒 (TiLV) 是一种影响全球罗非鱼养殖的致病病毒，研究提出一种基于纳米孔单分子技术结合扩增子测序的方法。对感染后的鱼类临床样本采样后，应用这种方法快速确认了（在不到12小时内）的PCR 扩增子序列和罗非鱼湖病毒 (TiLV) 的基因分型。
尽管在单碱基读取水平上纳米孔测序的错误率较高，但通过矫正后获得的一致性序列与在Illumina平台和sanger平台获取的序列具有极高的一致性（一致性99.83-100%）。
这项研究表明，结合扩增子的纳米孔测序平台十分具有前景，可以有效在中低收入国家的区域水生动物健康诊断实验室中使用，以便在一天内快速、准确地鉴定和基因分型新出现的传染性病原体。
参考文献：
[1]O'Donnell VK, Grau FR, Mayr GA, et al. Rapid Sequence-Based Characterization of African Swine Fever Virus by Use of the Oxford Nanopore MinION Sequence Sensing Device and a Companion Analysis Software Tool. Journal of Clinical Microbiology.2019 Dec 23;58(1):e01104-19. doi: 10.1128/JCM.01104-19.
[2] da Silva AP, Aston EJ, Chiwanga GH, Birakos A, Muhairwa AP, Kayang BB, Kelly T, Zhou H, Gallardo RA. Molecular Characterization of Newcastle Disease Viruses Isolated from Chickens in Tanzania and Ghana. Viruses. 2020; 12(9):916. https://doi.org/10.3390/v12090916.
[3] Delamare-Deboutteville J, Taengphu S, Gan HM, et al. Rapid genotyping of tilapia lake virus (TiLV) using Nanopore sequencing. Journal of Fish Diseases. 2021 Oct;44(10):1491-1502. DOI: 10.1111/jfd.13467.
齐碳与大家总结分享目前基于纳米孔测序技术在动物疫病防控中的相关研究成果，为动物疫病防控领域研究提供新思路。
1、利用纳米孔测序技术对非洲猪瘟进行快速全基因组测序
O'Donnell VK, Grau FR, Mayr GA, Sturgill Samayoa TL, Dodd KA, Barrette RW.
▲DOI:
10.1128/JCM.01104-19
▲解读
非洲猪瘟病毒 (ASFV) 是一种严重且高度传染性的猪病毒病的病原体，由于高死亡率和对国际贸易的影响，对养猪业造成严重的经济后果。没有有效的疫苗来控制非洲猪瘟 (ASF)，因此，有效的疾病控制取决于 ASFV 的早期检测和诊断。较大ASFV 基因组(~180 kb) 阻碍了快速获得全基因组序列的能力。然而快速获取数据对于鉴定分离株和支持流行病学工作至关重要。
该研究通过长读长测序技术与开发的配套脚本（非洲猪瘟快速分析测序工具ASF-FAST) 结合使用时，可以实时分析输出数据。完整的 ASFV 基因组序列来自细胞培养分离物和实验感染猪的血液样本中产生的。从提取的核酸中去除宿主 DNA 有助于快速鉴定 ASFV 序列，在测序开始后 6 分钟内检测到 ASFV 特异性序列。无论起始材料如何，都可以在 10 分钟内获得足够的序列覆盖病毒全基因组。总体而言，该研究重点介绍了纳米孔测序技术与 ASF-FAST 软件的结合使用，目的是快速、实时地从诊断样本中分离出完整的 ASFV 基因组。
2、坦桑尼亚和加纳鸡新城疫病毒的分子特征研究
da Silva AP, Aston EJ, Chiwanga GH, Birakos A, Muhairwa AP, Kayang BB, Kelly T, Zhou H, Gallardo RA.
▲DOI:
https://doi.org/10.3390/v12090916
▲解读
虽然新城疫（ND）在许多非洲国家流行，但有关流行基因型的信息仍然很少。在坦桑尼亚，报告了基因型为V型和XIII型的疫情。在西非和中非，基因型 XIV、XVII 和 XVIII 最为主要。为了研究在坦桑尼亚和加纳的其他基因型，本文作者使用纳米孔基因测序技术对来自坦桑尼亚和加纳的分离株进行了基因分型。研究人员成功地对来自坦桑尼亚的24个分离株和来自加纳的4个样本的NDV F基因高变区进行了测序。在坦桑尼亚，发现了基因型V型、VII型和XIII型。来自加纳的所有分离株都属于基因型XVIII。本研究获得的数据反映了非洲NDV的遗传多样性，并强调了监测对监测NDV基因型分布和病毒进化的重要性。
II类新城疫病毒系统发育分析
3、利用纳米孔测序对罗非鱼湖病毒(TiLV)进行快速基因分型
Jerome Delamare-Deboutteville, Suwimon Taengphu, Han Ming Gan, Pattanapon Kayansamruaj, Partho Pratim Debnath, Andrew Barnes, Shaun Wilkinson, Minami Kawasaki, Chadag Vishnumurthy Mohan, Saengchan Senapin, Ha Thanh Dong.
▲DOI:
https://doi.org/10.1111/jfd.13467
IMFORMATION
▲解读
传染病是可持续水产养殖生产面临的主要挑战之一。在疑似疾病病例早期对新出现的病原体进行快速、准确的诊断和基因分型，对及时响应、部署适当的控制措施并预防或减少传染病传播至关重要。目前，大多数实验室使用 PCR 来扩增病原体的基因组区域，并结合使用传统 的Sanger 测序以辅助验证。但这种方法主要的缺点是检测周期长。
罗非鱼湖病毒 (TiLV) 是一种影响全球罗非鱼养殖的致病病毒，研究提出一种基于纳米孔单分子技术结合扩增子测序的方法。对感染后的鱼类临床样本采样后，应用这种方法快速确认了（在不到12小时内）的PCR 扩增子序列和罗非鱼湖病毒 (TiLV) 的基因分型。
尽管在单碱基读取水平上纳米孔测序的错误率较高，但通过矫正后获得的一致性序列与在Illumina平台和sanger平台获取的序列具有极高的一致性（一致性99.83-100%）。
这项研究表明，结合扩增子的纳米孔测序平台十分具有前景，可以有效在中低收入国家的区域水生动物健康诊断实验室中使用，以便在一天内快速、准确地鉴定和基因分型新出现的传染性病原体。
利用TiLV共识序列进行序列比对，鉴定单核苷酸多态性（SNPs）
参考文献：
[1]O'Donnell VK, Grau FR, Mayr GA, et al. Rapid Sequence-Based Characterization of African Swine Fever Virus by Use of the Oxford Nanopore MinION Sequence Sensing Device and a Companion Analysis Software Tool. Journal of Clinical Microbiology.2019 Dec 23;58(1):e01104-19. doi: 10.1128/JCM.01104-19.
[2] da Silva AP, Aston EJ, Chiwanga GH, Birakos A, Muhairwa AP, Kayang BB, Kelly T, Zhou H, Gallardo RA. Molecular Characterization of Newcastle Disease Viruses Isolated from Chickens in Tanzania and Ghana. Viruses. 2020; 12(9):916. https://doi.org/10.3390/v12090916.
[3] Delamare-Deboutteville J, Taengphu S, Gan HM, et al. Rapid genotyping of tilapia lake virus (TiLV) using Nanopore sequencing. Journal of Fish Diseases. 2021 Oct;44(10):1491-1502. DOI: 10.1111/jfd.13467.
