Ampha Z32的应用：花粉作为外源基因媒介的小麦遗传转化
花粉使植物能够通过异花受精转移雄性配子，创造新的遗传变异。受精、胚胎发生和种子发育的命运取决于花粉维持其活力的能力，以便将封闭的配子传递给等待的胚珠。由于花粉容易获取，且在将遗传物质传递给胚珠方面具有明确的作用，自19世纪以来，花粉一直被用作外源 DNA 的载体。花粉介导的遗传转化可以通过未成熟、发育中的花粉(称为小孢子)或成熟的花粉粒来实现。利用成熟花粉粒的优点是，转染后的花粉粒有直接用于胚珠受精产生转基因后代的潜力；相比之下，小孢子的遗传转化则需要组织培养再生技术来产生双单倍体转基因植株。基于此，人们逐渐尝试将花粉作为外来物质的载体进行不同作物的遗传转化的研究，如通过简单的花粉照射和DNA-花粉的复合作用对玉米遗传资源进行基因改良，就能够获得高达9.29%的转化效率；但遗憾的是，不论是使用根癌农杆菌进行直接转化，还是花粉作为DNA载体，均未能在小麦（Triticum aestivum L.）成熟花粉介导的基因改良中取得令人满意的转化效率，这是由于小麦复杂的基因组结构及其对花药/组织培养技术的高度基因型特异性反应的限制。
通过质粒或CRISPR/Cas9核糖核蛋白(RNP)复合体转染小麦花粉，如何在处理期间保持小麦花粉活力，是以花粉为基础的小麦遗传转化的难点。本文中悉尼大学Mehwish Kanwal等人研究了七个不同小麦基因型的花粉形态（大小、形状和孔径）及其在一系列萌发培养基中的活力，以评估利用花粉作为外源基因媒介进行小麦遗传转化的可行性。
扫描电镜（SEM）对花粉形态的检测结果表明，七种小麦基因型的花粉均为单孔型，结构没有显著差异，但成熟花粉粒的大小和孔径大小存在较大差异，其中小孔是花粉管萌发的位置，会促进了各种生理过程，包括扩散和内吞作用，有助于吸收外源性材料，这可能会影响外源物质(如质粒DNA、CRISPR RNPs)内化到水合花粉中的能力。
表1 基于扫描电子显微镜（SEM）的七种小麦基因型的花粉形态
*在每个小麦基因型的30粒花粉粒上记录了花粉极轴长度（P）、花粉赤道轴长度（E）和孔径的测量值。通过LSD检验，在p=0.05时，列中的相同字母表示无显著性差异。
鉴于此前研究者所建立的小麦离体萌发培养基并不适用于本次研究中所使用的七种小麦基因型，Mehwish Kanwal等人在本次研究中对BK碱性萌发培养基进行了一系列改良，结果表明小麦花粉在含有5%蔗糖、10%PEG4000、100mg/L硼酸、200mg/L硝酸钙、100mg/L硝酸钾和100mg/L硫酸镁的pH=6.5培养基中，在20±2℃下水合5小时后可达到了最高的萌发率。与此同时，本研究还利用Ampha Z32花粉活力分析仪(IFC，瑞士Amphasys)对七种小麦基因型的花粉活力进行同步检测，结果表明IFC法与体外萌发法的结果之间具有强相关性(R2= 0.947)，IFC法明显优于IKI染色法。
在本次研究的受控条件下储存小麦花粉，可有效延长其活力长达5小时，并能在优化的培养基中成功发芽，这为进一步研究花粉作为外源基因媒介进行小麦遗传转化和基因编辑协议提供了重要的信息。
—— 原文 ——
Kanwal, M.; Gogoi, N.; Jones, B.; Bariana, H.; Bansal, U.; Ahmad, N. Pollen: A Potential Explant for Genetic Transformation in Wheat (Triticum aestivum L.). Agronomy 2022, 12, 2009.
由于相关研究内容非常专业，难免有些理解不准确或者编辑整理的疏漏，请以英文原文为准。
通过质粒或CRISPR/Cas9核糖核蛋白(RNP)复合体转染小麦花粉，如何在处理期间保持小麦花粉活力，是以花粉为基础的小麦遗传转化的难点。本文中悉尼大学Mehwish Kanwal等人研究了七个不同小麦基因型的花粉形态（大小、形状和孔径）及其在一系列萌发培养基中的活力，以评估利用花粉作为外源基因媒介进行小麦遗传转化的可行性。
图1 本研究所用方法总体示意图
缩写：a，花药；f、花丝；lo，浆片；p、 内稃/内颖；PGM，花粉萌发培养基；s、柱头扫描电镜（SEM）对花粉形态的检测结果表明，七种小麦基因型的花粉均为单孔型，结构没有显著差异，但成熟花粉粒的大小和孔径大小存在较大差异，其中小孔是花粉管萌发的位置，会促进了各种生理过程，包括扩散和内吞作用，有助于吸收外源性材料，这可能会影响外源物质(如质粒DNA、CRISPR RNPs)内化到水合花粉中的能力。
表1 基于扫描电子显微镜（SEM）的七种小麦基因型的花粉形态
图2 扫描电镜下的不同小麦基因型花粉粒
（A） 单孔小麦花粉粒；（B） Gladius+Sr50花粉的赤道面观，显示5µm的表面孔径；（C）Thatcher花粉赤道面观，显示4µm孔径；（D） Lilian花粉的略斜极面观，孔径为3µm；（E） 花粉在羽状分枝柱头表面萌发（用*表示）。鉴于此前研究者所建立的小麦离体萌发培养基并不适用于本次研究中所使用的七种小麦基因型，Mehwish Kanwal等人在本次研究中对BK碱性萌发培养基进行了一系列改良，结果表明小麦花粉在含有5%蔗糖、10%PEG4000、100mg/L硼酸、200mg/L硝酸钙、100mg/L硝酸钾和100mg/L硫酸镁的pH=6.5培养基中，在20±2℃下水合5小时后可达到了最高的萌发率。与此同时，本研究还利用Ampha Z32花粉活力分析仪(IFC，瑞士Amphasys)对七种小麦基因型的花粉活力进行同步检测，结果表明IFC法与体外萌发法的结果之间具有强相关性(R2= 0.947)，IFC法明显优于IKI染色法。
图3 几种因素对Gladius+Sr50小麦品种萌发率（%）的影响
（a）不同pH值（LSD 0.05=8.49%）；（b） 不同浓度的硼酸（mg/L）（LSD 0.05=6.81%）；（c） 不同浓度的硝酸钙（mg/L）（LSD 0.05=7.76%）。
图4 体外萌发法（73.11±8.62%）与IFC法花粉活力（74.44±2.80%）检测结果对比
在本次研究的受控条件下储存小麦花粉，可有效延长其活力长达5小时，并能在优化的培养基中成功发芽，这为进一步研究花粉作为外源基因媒介进行小麦遗传转化和基因编辑协议提供了重要的信息。
—— 原文 ——
Kanwal, M.; Gogoi, N.; Jones, B.; Bariana, H.; Bansal, U.; Ahmad, N. Pollen: A Potential Explant for Genetic Transformation in Wheat (Triticum aestivum L.). Agronomy 2022, 12, 2009.
由于相关研究内容非常专业，难免有些理解不准确或者编辑整理的疏漏，请以英文原文为准。
