QCM技术在病毒-宿主（细胞）相互作用研究方面的应用

一、QCM方法：

石英晶体微天平（Quartz Crystal Microbalance，QCM）是一种非常灵敏的质量检测方法，其测量精度可达纳克级别，比灵敏度在微克级的电子微天平高100 倍，理论上可以测到的质量变化相当于单分子层或原子层的几分之一。石英晶体微天平利用了石英晶体谐振器的压电特性，将石英晶振电极表面质量变化转化为石英晶体振荡电路输出电信号的频率变化，进而通过计算机等其他辅助设备获得高精度的数据。

利用QCM技术，可以通过石英谐振器频率的变化感知芯片表面质量的变化，生成感应曲线，其敏感度可达到分子水平。实验时，只需将细胞、抗原或抗体等包被于芯片表面，将含有与之互作分子的溶液流过芯片表面，石英谐振器即可检测分子间结合﹑解离等整个变化过程，生成一张传感图，提供动力学亲和力等数据分析。

二、病毒与宿主研究方向的应用：

1、病毒侵染细胞

《四聚体氨基酸基序特性在蛋白酶活化病毒载体功能研究中的作用》

T. M. Robinson, J. Judd, M. L. Ho. Role of Tetra Amino Acid Motif Properties on the Function of

Protease-Activatable Viral Vectors[J]. ACS Biomater Sci Eng. 2016 Nov; 2(11): 2026-2033.

四聚体氨基酸在 蛋白酶活化型病毒（PAVs） 表面形成“肽锁”结构，其作用是，在没有蛋白酶存在的情况下，“肽锁”锁定，病毒不能与宿主细胞表面受体结合； 在MMP（基质金属蛋白酶）存在的情况下，“肽锁”的四聚体基序被酶破坏，PAVs可定位于病理学位点区域的目标细胞（该区域细胞具有升高的胞外蛋白酶特征），与细胞结合，将遗传物质核酸导入细胞内，而将蛋白质衣壳留在胞外（细胞膜上）。

研究者通过改变四聚体基序的特性，研究PAVs病毒载体与宿主细胞表面受体结合之间的关系，及其可能的机制。

在研究过程中，可以考虑采用以QCM技术为原理的仪器直接检测病毒与细胞表面受体结合并导入核酸后在胞外（膜上）留下蛋白质衣壳的过程，与常规的Western Blotting（蛋白免疫印迹法）和 银染法相比，QCM技术具有更加简便快捷和直观的优点。

2、与病毒诱导相关的细胞表达产物

《抑制Tip60可降低卡波氏肉瘤相关疱疹病毒（KSHV)的裂解及其潜伏基因的表达并降低KSHV感染型肿瘤细胞的增殖》

Sydney Simpson, Guillaume Fiches, Maxime J. Jean. Inhibition of Tip60 Reduces Lytic and Latent Gene Expression of Kaposi’s Sarcoma-Associated Herpes Virus (KSHV) and Proliferation of KSHV-Infected Tumor Cells[J]. Front. Microbiol. 2018 Apr; 9:788.

卡波氏肉瘤相关疱疹病毒（KSHV）是一种致瘤性病毒。对于免疫功能缺陷的个体，KSHV可诱发卡波氏肉瘤、原发型渗出性淋巴瘤（PEL）以及多中心型卡斯特曼病。

Tip60（一种组蛋白乙酰转移酶，HAT）在此前的研究中已显示出和KSHV潜伏期相关核抗原蛋白（LANA, 维持病毒潜伏状态的主要因子）以及 ORF36（在裂解期表达的病毒激酶）具有相互作用。

研究者进一步调查了Tip60-病毒相互作用的关系，以确定Tip60在病毒生命周期中的作用及其作为未来靶点治疗的潜力。

通过在携带 含KSHV病毒附加体Bac36的质粒的HEK293T细胞中调节Tip60表达，发现Tip60对裂解复制以及潜在基因的有效表达都是至关重要的。Tip60的小分子抑制剂MG149和NU9056可类似地抑制潜伏和裂解基因，并且在野生型KSHV+/EBV-PEL，BCBL-1细胞中减少病毒产生。

在研究过程中，为了检测药物处理后细胞中Tip60以及相关蛋白的表达量，可以在对细胞收获并裂解处理后，使用包被了相应蛋白抗体的芯片、在利用QCM方法学的仪器上进行检测，使实验过程更加简便快捷。

3、抗原-抗体相互作用

《通过在平板表面固定缀合环肽以有效模拟HCV病毒包膜E2蛋白 作为 合成疫苗的策略》

Meuleman TJ, Dunlop JI, Owsianka AM. Immobilization by Surface Conjugation of Cyclic Peptides for Effective Mimicry of the HCV-Envelope E2 Protein as a Strategy toward Synthetic Vaccines[J]. Bioconjug Chem. 2018 Apr; 29(4):1091-1101.

使用基于肽的调节剂（即，抗原表位模拟物）对抗体-抗原相互作用的结合界面进行模仿，具有应用于疫苗设计的前景。

研究者采用配备了硫醇部分、可以用于支持环状或线性多肽的柔性TEG接头合成官能化的溴化物衍生物，环状和线性表位模拟物通过马来酰亚胺活化的平板表面上的游离硫醇部分共价缀合。

对具有共价、均一、定向包被表面的环状或线性表位模拟物进行ELISA实验，用以探究肽环化过程对于模拟的HCV E2糖蛋白抗体-抗原相互作用的影响。实验结果首次清楚地阐明环化肽优于线性肽的性能，且环状表位模拟物，而非线性表位模拟物，分别显示出对其单克隆抗体HC84.1和V3.2的特异性。

上述用于构建表位模拟物的策略通过简单地改变合成肽内的氨基酸序列显示出其对于高通量筛选关键结合残基的潜力。据此，438位的亮氨酸已被鉴定为结合单克隆抗体V3.2的关键结合残基。

在研究过程中，可以考虑采用以QCM技术为原理的仪器进行环状或线性表位模拟物结合抗体的特异性检测。与常规ELISA实验相比，QCM技术可以获得更多关于抗体-抗原相互作用的动力学信息以及靶标识别的准确度信息。

4、病毒诱导机体产生的体液免疫与细胞免疫（包括血清中的抗体“垂钓”）

《接种 辅助性T细胞 CD4位点封闭型 HIV-1 gp140包膜蛋白 疫苗的恒河猴具有强烈且持久的B细胞及ADCC免疫应答特性》

Willy M. J. M. Bogers, Susan W. Barnett, Herman Oostermeijer. Increased, Durable B-Cell and ADCC Responses Associated with T-Helper Cell Responses to HIV-1 Envelope in Macaques Vaccinated with gp140 Occluded at the CD4 Receptor Binding Site[J]. J Virol. 2017 Sep; 91(19).

HIV-1 包膜蛋白gp140或gp120可引发较弱的B细胞免疫应答反应，因其持续时间较短，需要更好的策略来提高HIV-1包膜蛋白的免疫原性，以获得更长久、更有效的HIV-1疫苗来诱导B细胞的免疫应答。

研究者假设病毒包膜蛋白与辅助性T细胞上的CD4受体结合导致了T细胞募集过程的失效，并因此缺乏强大、稳健和持久的记忆B细胞来参与以后的免疫应答过程。

为了验证此假设，研究者通过采用与3-kDa CD4小蛋白模拟物形成稳定交联的方法来封闭gp140的CD4结合位点，其作用在于阻断了gp140与CD4⁺辅助性T细胞的结合，同时保持了CD4的可诱导性，使ADCC（抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用）效应器可以把经过中和实验（灭活）处理的抗原表位作为靶标来启动相应的免疫应答反应。

研究者发现，与用gp140直接免疫处理的动物相比，接受CD4位点封闭疫苗处理的恒河猴能够始终表现出优越的B细胞应答动力学以及优越的ADCC特性。

对免疫反应中的细胞因子进行检测，发现在抗原诱导期，CD4位点封闭组的辅助性T细胞分泌的抗原特异性白细胞介素4（IL-4）增加得更早（该过程采用酶联免疫斑点法进行检测）。

所以，CD4位点封闭型gp140抗原可诱导优越的B细胞和ADCC应答，并且被增强的B细胞应答被证明是非常持久的，在免疫作用后可持续超过60周。

在研究过程，QCM方法可以替代 B细胞酶联斑点法实验、ADCC实验、T细胞酶联斑点法实验进行多种抗原-抗体、抗体-细胞、细胞-细胞的检测（包括对细胞因子或特异性抗体进行“垂钓”），可获得关于免疫应答过程的更详细的时间、强度及动力学特性等数据。

       综上，由于QCM技术的高灵敏性、检出过程无需对分子进行标记、既可以进行分子与分子，又可以进行细胞与分子间相互作用的研究，且对于作用过程能够提供详细的动力学信息等优点，目前已在细胞表面的动力学反应、抗原抗体反应、竞争力分析、配体垂钓、抗原表位定位等领域广泛运用。在病毒-宿主（细胞）相互作用方面，可以考虑使用以QCM技术为原理的仪器替代或补充其他传统研究手段，进一步增强科研能力与效率。

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