小檗碱通过调节信号通路抑制低剪切应力诱导的糖萼降解
动脉粥样硬化是一种大动脉疾病，其发病机制的起始步骤是血管内皮屏障功能障碍。覆盖在内皮细胞表面的糖萼是维持内皮和血管功能的非常关键的“器官”。越来越多的证据表明，内皮糖萼不完整性导致血管系统对致动脉粥样硬化和炎症的敏感性增加。作为糖萼的主要成分，透明质酸（HA）可以微调细胞行为，能监测和放大内皮细胞膜上的流动引起的剪切应力。
活性氧（ROS）不仅对糖萼构成直接威胁，而且还可以通过激活基质金属蛋白酶（MMPs）和内源性蛋白酶抑制剂的失活来增强糖萼的蛋白水解，可以降解胶原蛋白，透明质酸和层粘连蛋白，所有这些都是细胞外基质（ECM）的主要组成部分，导致糖萼层的根本破坏。
低剪切应力（LSS）会导致活性氧的产生过多，超过系统的局部抗氧化能力，进而导致糖萼降解。显然，低剪切应力刺激和氧化应激之间存在恶性循环，两者协同作用可能会使糖萼退化。但是，低剪切应力诱导的内皮功能障碍的发病机制在很大程度上仍不清楚。
小檗碱（BBR）也叫黄连素，是从中药黄连中分离出来的一种生物碱，具有多种药理和生物学活性，例如抗菌活性、抗炎、抗氧化应激和心脏保护作用。先前的研究表明，低剪切应力通过增加p47 phox的磷酸化以及增加的活性氧产生来损害糖萼。然而，低剪切应力诱导的糖萼降解和小檗碱之间的相互作用，以及小檗碱对低剪切应力损伤的内皮的保护作用的机制，仍然未知。
因此，江苏大学附属医院重症医学科、南京医科大学第一附属医院心血管内科、扬州大学附属医院心血管内科的一项联合研究旨在探索小檗碱是否减弱了细胞和动物模型中低剪切应力诱导的糖萼降解，并阐明了潜在的分子机制。
小檗碱改善低剪切应力诱导的透明质酸降解
低剪切应力可以促进透明质酸的降解，其降解可以促进炎症反应。相反，小檗碱已被证明在抑制炎症方面起着关键作用。因此，实验决定确定小檗碱是否参与透明质酸代谢的调节。首先，将HUVECs暴露在指定的时间（0、5、15、30、60和120 min）的低剪切应力（2 dyne/cm2）下。免疫荧光分析显示，透明质酸表达明显降低，在暴露于低剪切应力30 min时达到最小值（图1）。其次，用不同剂量（0、5 μmol/l、10 μmol/l和20 μmol/l）对HUVECs进行预处理24 h，然后暴露于低剪切应力下，结果表明，小檗碱降低了低剪切应力诱导的透明质酸降解，且呈浓度依赖性（图1 B）。
为了确定小檗碱降低体外透明质酸降解的作用是否可以转化到小鼠模型，通过免疫荧光测量了透明质酸的表达并量化了IHC载玻片。结果表明，与对照组相比，小檗碱处理显著恢复了主动脉血管组织中透明质酸的表达（图1 C、D）。
图1 小檗碱改善低剪切应力诱导的HA降解
小檗碱抑制低剪切应力诱导的NADPH氧化酶激活
作为活性氧的主要来源，NADPH-氧化酶在血管细胞糖萼的代谢中起着至关重要的作用。以前的研究表明，低剪切应力和小檗碱对NADPH氧化酶的活性具有相反的影响，其中低剪切应力诱导NADPH氧化酶激活，而小檗碱抑制NADPH氧化酶活化。在这项研究中，证实了低剪切应力可以提高p47phox的磷酸化水平并在体外激活NADPH 氧化酶 2（NOX2）。此外，还显示低剪切应力下内皮细胞中p47phox的磷酸化水平显著高于静态组。免疫共沉淀分析表明，低剪切应力增加了p47phox和NOX2的结合，这可能导致NADPH氧化酶的活化。然而，用小檗碱预处理后，p47phox磷酸化和NOX2活化都受到抑制，p47phox和NOX2的结合也在体外降低，伴随着活性氧产生的减少。
有趣的是，小檗碱处理导致p47phox 的基础磷酸化水平升高，但与对照组相比，当暴露于低剪切应力时，这种变化没有进一步增加。小檗碱处理组和对照组的活性氧和NO的基础水平都没有明显变化。同样，小檗碱不仅不增加细胞凋亡，而且还减少低剪切应力诱导的细胞凋亡。
小檗碱抑制LSS诱导的Hyal2激活并调节p47phox和 Hyal2的串扰
作为调节HA代谢的主要酶，透明质酸氨基葡糖苷酶2（Hyal2）在HA消化中起着至关重要的作用。体外蛋白质印迹和免疫荧光均显示，暴露于低剪切应力后，Hyal2表达显著增加（图2 B、E）。为了确定小檗碱是否也与Hyal2的激活有关，用小檗碱（5μM、10μM、20μM）预处理细胞24小时，然后暴露于低剪切应力。蛋白质印迹显示，小檗碱抑制Hyal2活化（图2 C、D），免疫荧光分析也证明小檗碱可以降低Hyal2表达（图2 E）。与p47phox磷酸化的变化类似，体内小檗碱预处理后Hyal2表达也降低（图2 A）。
此外，发现p47phox沉默后，小檗碱未能进一步抑制低剪切应力诱导的Hyal2激活，表明小檗碱通过调节p47phox抑制Hyal2的活性。同样，当 p47phox过表达时，小檗碱不能有效抑制Hyal2活化；当Hyal2沉默时，小檗碱也不能抑制低剪切应力诱导的 p47phox 磷酸化。此外，发现小檗碱可以增加p47phox/Hyal2 的结合。
图2 小檗碱抑制LSS诱导的Hyal2激活
小檗碱逆转低剪切应力诱导的AMPK去磷酸化
研究表明，小檗碱对糖尿病和肥胖症有益，至少部分是通过调节AMPK活性。因此，假设小檗碱可能会逆转低剪切应力诱导的AMPK磷酸化水平降低。图3 A表明，低剪切应力降低了AMPK的磷酸化水平。用小檗碱预处理后，可以逆转低剪切应力诱导的AMPK去磷酸化（图3 C）。为了证明小檗碱激活AMPK的功效，用不同浓度的小檗碱（5μM、10μM、20μM）预处理HUVECs 24小时，然后暴露于低剪切应力。蛋白质印迹显示，小檗碱可以以剂量依赖性方式显著增加AMPK的磷酸化水平（图3 B）。
图3 小檗碱通过逆转低剪切应力诱导的 AMPK 抑制抑制p47phox和 Hyal2 激活
小檗碱通过AMPK活化抑制HUVECs中p47phox 磷酸化和Hyal2活化
考虑到小檗碱恢复了低剪切应力诱导的AMPK去磷酸化，实验试图确定小檗碱是否通过激活 AMPK减弱低剪切应力诱导的p47phox磷酸化和 Hyal2 活化。结果表明，在与小檗碱和化合物C（AMPK抑制剂）共同处理后，低剪切应力可以消除p47phox和Hyal2对小檗碱的响应（图3 D）。为了进一步在小檗碱处理中连接 AMPK 与 p47phox和Hyal2，通过敲低AMPKα1，然后用小檗碱预处理24小时，在低剪切应力下，小檗碱不能抑制p47phox磷酸化和Hyal2活化（图3 E-G）。此外，实验确定了p47phox和Hyal2的结合是否也受到小檗碱处理的影响。结果表明，小檗碱降低了低剪切应力诱导的p47phox/Hyal2 的解离（图3 H）。所有数据都显示，小檗碱通过 AMPK 激活抑制p47phox和 Hyal2的活化。
小檗碱逆转HAS2的表达也依赖于AMPK活化
透明质酸合酶-2（HAS2）是透明质酸最广泛表达的酶，也是合成透明质酸的关键酶。在这项研究中，蛋白质印迹显示，低剪切应力以时间依赖性方式下调HAS2表达，30min时HAS2表达最小。然而，小檗碱可以改善低剪切应力降低的HAS2表达，且呈剂量依赖性。
为了研究低剪切应力降低HAS2表达的潜在机制至少部分是由于AMPK活性的变化，实验用小檗碱和化合物C共同处理细胞，然后暴露于低剪切应力。蛋白质印迹显示，小檗碱处理不能逆转HAS2表达的降低，表明AMPK参与了HAS2表达的调节。此外，在敲低AMPKα1的同时，HAS2表达的变化也不受小檗碱处理的影响。相反，通过过表达AMPKα1然后暴露于低剪切应力，与对照组相比，HAS2表达显著增加。这些结果表明，小檗碱通过AMPK通路调节HAS2活性。
然而没有发现AMPK和HAS2之间的直接联系。因此，测试了p47phox 是否参与HAS2的介导。用p47phox siRNA转染时，低剪切应力不能显著降低HAS2的表达。因此，低剪切应力通过AMPKα/p47phox 通路诱导HAS2表达的变化。
总之，小檗碱调节低剪切应力诱导的透明质酸降解不仅抑制了p47phox 和Hyal2活性，也增强了HAS2的表达。
图4 BBR介导透明质酸代谢作用的示意图
BBR可以逆转LSS诱导的透明质酸损伤。该过程可能是通过调节AMPK活化，然后减少p47phox的磷酸化和 Hyal2 激活。此外，BBR还减弱了LSS诱导的HAS2失活。同样，HAS2的表达也受到AMPK活性的调节。因此，合成和分解代谢均受BBR调节。
总之，该研究表明，小檗碱处理可以通过增加AMPKa的磷酸化来减弱低剪切应力诱导的透明质酸降解，进而下调 p47phox和Hyal2活性，并上调HAS2的表达。
参考文献：Yang H, Zhu L, Gu Y, Kong X, Yan Liu, Chen M, Xie X, Luo J, Chen S. Berberine inhibits low shear stress-induced glycocalyx degradation via modulating AMPK and p47phox/Hyal2 signal pathway. Eur J Pharmacol. 2019 Aug 5;856:172413. doi: 10.1016/j.ejphar.2019.172413. Epub 2019 May 29. PMID: 31152700.
