Cre-lox系统介绍及使用汇总

1987年Brian Sauer博士报道了Cre-loxP重组系统可用在细胞中操作特定位点的特异性重组，由于该系统具有操作简单、重组率高的优点，如今已成为体内外遗传操作的常用工具。现在利用Cre-lox系统，我们可以在特定细胞、组织或整个生物体，甚至在特定时间点敲除或表达某个基因，实现对特定基因的时空特异性操作，这对基因功能的研究和人类疾病动物模型的建立都有重大意义。

1.什么是Cre-lox系统？
从名字就能知道这套系统的两个主要组成部分：

Cre重组酶
环化重组酶（Cre, cyclization recombinase），是酪氨酸位点特异性重组酶之一，能催化两个DNA识别位点之间的位点特异性重组。Cre重组酶来源于P1噬菌体，由 343个氨基酸组成，能特异性地识别Lox位点。除Cre以外，此类重组酶还有Flp（flipase）和Dre（D6特异性重组酶）。

Lox位点
Cre重组酶识别的回文DNA位点，也叫loxP (locus of X-over P1) 位点，长34bp，其特征结构为 ATAACTTCGTATA -NNNTANNN-TATACGAAGTTAT。两边反向互补的13个碱基为Cre重组酶的识别序列，中间的8个碱基为重组发生位置，这也决定了loxP的方向。N表示可变碱基，不同的碱基选择可形成不同的 Lox位点，除了野生型loxP，常见的还有 Lox2272，Lox511，Lox5171等。
 

图1 . loxP位点及其突变体位点（图片来自Ref.1）
 

在同一个 DNA 分子上，根据Lox位点的位置与方向，可能会发生3种不同的重组事件：

（1）切除：当两个Lox位点在同一染色体上且方向相同时，将切除同向Lox位点之间的DNA序列。

（2）反转：当两个Lox位点位于同一染色体上且方向相反时，两个Lox位点之间的序列发生序列反转，即颠倒。

（3）易位：如果两个Lox位点位于不同的染色体上且方向相同，将导致2条染色体上DNA片段的交换。
 

图2. Cre的重组机制。A）loxP位点的基本结构。红色箭头指示loxP位点的方向。B）Cre-loxP介导的易位重组。C）左图示Cre介导两同向loxP位点间的切除重组。右图示Cre介导两反向loxP位点间的反转重组。（图片来自Ref.2）

2.体内Cre-lox系统的基础应用
Cre-lox系统通常包括两种小鼠：一是Cre工具鼠，该小鼠中的Cre重组酶由特定启动子驱动，可在特定细胞或组织表达Cre重组酶；二是Flox小鼠，即在小鼠靶基因序列两侧带有Lox位点。将上述两种小鼠杂交繁育，子代中可以获得既带有Cre又带有Flox基因的小鼠，即基因条件性敲除或过表达小鼠。

2.1基因条件性表达
基因条件性表达所需要的Flox小鼠，一般在靶基因与启动子之间有一个“终止盒”（lox-stop-lox）。这些Flox小鼠与细胞类型特异性表达Cre的转基因小鼠交配后获得的子代小鼠中，在每个表达Cre重组酶的细胞中，终止盒被Cre切除，因此仅在这些细胞中表达所需的转基因。
 

图3. 条件性基因表达小鼠原理示意图（图片来自Ref.3）

2.2 基因条件性敲除
基因条件性敲除的Flox小鼠，一般在需要切除的DNA片段两侧带有同方向的两个Lox位点（lox-GENE-lox）。与细胞类型特异性Cre小鼠交配后，Cre 重组酶会识别Lox位点，导致靶基因被敲除。
 

3. 更精准的诱导型Cre-lox系统
为了能够更准确地进行遗传功能研究，时间特异性的Cre-lox（也叫诱导型Cre-lox）被开发出来，可用于研究生物体发育过程特定阶段的基因功能，或用来进行谱系示踪等。常用诱导型Cre-lox系统有：

3.1 CreER系统
也叫他莫昔芬（Tam）诱导的Cre系统，将Cre与雌激素受体ER融合，可通过他莫昔芬（Tam）诱导Cre的重组活性。在没有他莫昔芬的情况下，CreER融合蛋白与热休克蛋白90（HSP90）相互作用并存在于细胞质中（图5.1）。给予他莫昔芬药物处理会破坏HSP90与CreER的相互作用（图5.2）。ER与Tam的相互作用诱导Cre的核易位（图5.3）。在细胞核中，CreER识别loxP位点（图5.4）并使组织X中的基因Y失活（图5.5）。CreERT2在体内对药物诱导的敏感性更高，因此一般优选使用CreERT2。
 

3.2 Cre;Tet系统
四环素诱导系统，也叫强力霉素（Dox，四环素衍生物）诱导的Cre系统。该系统有两种模式：Tet-on和Tet-off，分别是Dox依赖性Cre的激活和Dox依赖性Cre的失活。Tet系统包括以下元件：反向四环素控制反式激活因子（rtTA）；四环素控制反式激活因子（tTA）；四环素响应元件（TRE），通常是19个核苷酸的四环素操纵子（tetO）序列的7个重复，调节Cre基因的表达。Dox通常在小鼠的饲料或饮水中进行给药。

Cre;Tet-on系统：在Tet-on系统中，表达普遍存在的或组织特异性的启动子驱动的rtTA。在没有Dox的情况下，失活的rtTA无法与负责调控Cre基因的TRE序列结合，则Cre不表达。在Dox给药之后，Dox结合并激活rtTA。激活的rtTA与TRE序列结合并诱导Cre表达。
 

Cre;Tet-off系统：另一方面，在Tet-off系统中，在没有Dox的情况下，激活的tTA能够结合Cre前的TRE序列并诱导Cre表达。而在Dox给药后，与Dox相互作用的tTA被灭活。灭活的rTA不再与TRE结合，因此Cre表达受到抑制。

4.南模生物Cre工具鼠库
南模生物可提供超过300多种自主产权Cre工具鼠，覆盖全身各类型的细胞组织，满足科研人员多样化的需求。同时，我们还在对Cre工具鼠进行全面的验证，目前已经完成了100多种Cre工具鼠的验证工作。

 

为了方便大家更快的找到自己想要的Cre工具鼠，我们还特别定制了Find Cre搜索系统，该系统现已在官网上线，免费使用。Find Cre整个界面以小鼠组织、器官和系统为主线，可分为肺、肝、胃肠道、乳腺、胰腺、感觉器官、心血管系统、免疫系统、神经系统、泌尿生殖系统、骨骼肌系统以及其他组织器官。选择自己感兴趣的组织器官，就可以查看该组织下可用的Cre工具鼠。

部分Cre品系验证数据如下：

1 Myh6-Cre
Myh6特异性靶向小鼠心肌细胞，验证数据证明Myh6-Cre鼠是可以用于心脏特异性基因编辑的工具鼠。

 

图8. 荧光检测tdTomato在Myh6-Cre; Rosa26 tdTomato 小鼠胚胎中的表达，结果表明在E13.5和E14.5天小鼠心肌细胞均有tdTomato表达。

2 Alb-CreERT2
Alb-CreERT2小鼠是研究肝脏基因功能与疾病的重要小鼠品系，验证数据证明Alb-CreERT2小鼠可以成为实现肝脏时间特异性敲除或表达的工具鼠。

图9. Alb-CreERT2; Rosa26-LacZ小鼠肝组织X-gal染色。未使用他莫昔芬诱导的小鼠，肝细胞未被染色；使用他莫昔芬诱导的小鼠，肝细胞成功着色。
  图10. Alb-CreERT2; Rosa26-LacZ小鼠肝组织免疫荧光检测。Alb-CreERT2; Rosa26-LacZ小鼠被他莫昔芬诱导后，LacZ（红色）表达。
 

图11. Alb-CreERT2小鼠血生化检测。结果显示Alb-CreERT2小鼠与野生型小鼠相比肝功能正常

3 Pvalb-Cre
Pvalb-Cre在中间神经元中表达iCre重组酶，而不干扰内源性Pvalb表达。这些小鼠可能对研究神经元分化有用。

图12. 荧光检测Pvalb-Cre+/-; Rosa26 tdTomato+/-小鼠大脑皮层中间神经元tdTomato的表达。

 

图13. 荧光检测Pvalb-Cre+/-; Rosa26 tdTomato+/-小鼠海马中间神经元tdTomato的表达。
结果显示：双阳性小鼠海马中间神经元有tdTomato的表达，表达类型符合预期。

4 Ucp1-CreERT2
Ucp1-CreERT2在棕色脂肪中表达CreERT2重组酶，验证数据证明Ucp1-CreERT2小鼠是可以用于棕色脂肪特异性基因编辑的工具鼠。

图14. 荧光检测 Ucp1-CreERT2+/- ; R26-tdTomato+/-  小鼠棕色脂肪和白色脂肪中 tdTomato 的表达。Ucp1-CreERT2 小鼠与 R26-tdTomato 小鼠进行交配，取棕色脂肪组织和白色脂肪组织进行荧光显微镜拍照。实验结果显示 Ucp1-CreERT2 小鼠经 Tamoxifen 诱导后可以在棕色脂肪中表达。

5 Tyr-CreERT2
Tyr-CreERT2特异性靶向黑色素细胞，验证数据证明Tyr-CreERT2鼠是可以用于黑色素细胞特异性基因编辑的工具鼠。

图20. 荧光检测 Tyr-CreERT2+/- ; R26-tdTomato+/-  小鼠尾部表皮基底层的表达情况。
（A） R26-tdTomato+/-小鼠使用他莫昔芬诱导，表皮基底层的黑素细胞无红色荧光信号。
(B) Tyr-CreERT2+/- ; R26-tdTomato+/-小鼠腹腔注射玉米油，表皮基底层的黑素细胞无红色荧光信号。
（C） Tyr-CreERT2+/- ; R26-tdTomato+/-小鼠腹腔注射他莫昔芬，表皮基底层的黑素细胞出现红色荧光信号。
  图15. Tdtomato表达位置图；结论：Tyr-CreERT2+/- ; R26-tdTomato+/-  小鼠他莫昔芬诱导后表达在尾部皮肤基底层（白色虚线所示)的黑色素细胞（白色箭头所指）。

References

1. Missirlis PI, Smailus DE, Holt RA. Ahigh-throughput screen identifying sequence and promiscuity characteristics ofthe loxP spacer region in Cre-mediated recombination. BMC Genomics.2006;7:73. Published 2006 Apr 4. doi:10.1186/1471-2164-7-73
2. Tronche F, Casanova E, Turiault M, Sahly I, Kellendonk C. When reversegenetics meets physiology: the use of site-specific recombinases in mice. FEBSLett. 2002;529(1):116‐121. doi:10.1016/s0014-5793(02)03266-0
3. Magnuson M , Osipovich A . Pancreas-Specific Cre Driver Lines and Considerations for Their Prudent Use[J]. Cell Metabolism, 2013, 18(1):9-20.
4. Kim H, Kim M, Im SK, Fang S.Mouse Cre-LoxP system: general principles to determine tissue-specific roles oftarget genes. Lab Anim Res. 2018;34(4):147‐159. doi:10.5625/lar.2018.34.4.147
5. Song AJ, Palmiter RD. Detecting and Avoiding Problems When Using theCre-lox System. Trends Genet. 2018;34(5):333‐340.doi:10.1016/j.tig.2017.12.008
6. Duffield JS, Humphreys BD. Origin of new cells in the adult kidney:results from genetic labeling techniques. Kidney Int.2011;79(5):494‐501. doi:10.1038/ki.2010.338
7. Feil S, Valtcheva N, Feil R. Inducible Cre mice. Methods MolBiol. 2009;530:343‐363. doi:10.1007/978-1-59745-471-1_18
8. Holzenberger M, Lenzner C, Leneuve P, et al. Cre-mediated germline mosaicism:a method allowing rapid generation of several alleles of a target gene. NucleicAcids Res. 2000;28(21):E92. doi:10.1093/nar/28.21.e92
9. Becher B, Waisman A, Lu LF. ConditionalGene-Targeting in Mice: Problems and Solutions. Immunity. 2018;48(5):835‐836.doi:10.1016/j.immuni.2018.05.002