外泌体纯不纯，一闻就知
以外泌体为基础的细胞间通讯横跨所有生命领域。多项研究表明，与传统的合成载体相比，外泌体在药物递送方面具有若干优势，为现代药物输送开辟了新领域，使得外泌体近年来备受科研、产业界乃至资本市场的关注。但是以外泌体为基础的治疗的临床转化仍然面临着诸多挑战。其中，如何精准且快速地实现外泌体治疗制剂的质量控制成为外泌体产业化领域目前亟需解决的一项问题。2022年5月10日，国家发展改革委印发《“十四五”生物经济发展规划》（以下简称《规划》）。《规划》明确指出需建设外泌体治疗产品等新型治疗制剂及方案的质量及安全性评价技术平台。
外泌体来源环境复杂，其中往往存在大量脂蛋白、蛋白团聚体及其他非囊泡组分。高纯度外泌体的分离制备成为高质量外泌体制剂研发和生产的先决条件。但是由于外泌体不仅个体极其微小，携载的蛋白、核酸、脂类等“货物分子”含量极低，而且因来源细胞、细胞状态以及分泌途径的不同使得外泌体在尺寸、膜蛋白和内含物等方面存在高度的个体差异性和多样性。这些固有因素提出了在单颗粒水平对外泌体质量评估的这一重要需求。
传统表征方案
i. 至少3个外泌体标志蛋白（膜表面蛋白以及内腔蛋白）
ii. 至少一个阴性蛋白
i.电镜成像
ii.其他非电镜的单颗粒表征平台
此外，目前尚且没有关于工业生产外泌体的统一质量评估标准。因此，探索和确立适用于外泌体相关治疗产品的质控标准，将极大推动这一领域发展。
外泌体产品的多维度质量控制从外泌体的结构和组成出发，针对粒径、浓度和纯度等物理参数以及蛋白、核酸等生化指标，NanoFCM提出如下（图1）质量控制建议。
图1. 单EV水平的质量控制方法
图2. 单外泌体水平的粒径及浓度表征（左）稀释性测试（右）
图3. NanoFCM散射性能和稀释线性
(2) Triton X-100测定纯度
Triton X-100是一种表面活性剂，可裂解外泌体的膜结构。可通过对比裂解前后外泌体样品的颗粒数变化，得到外泌体样本纯度。如图4所示，经Triton X-100处理，该外泌体样品中颗粒数目明显下降，计算可得该外泌体样品纯度为66.0%。
图4. 基于Triton X-100膜处理的外泌体纯度检测
(3) 膜染料测定纯度
公司自主开发的膜染料可实现对外泌体样品中含有膜结构的颗粒的标记，从而实现样本纯度分析。如图5所示，经绿色荧光脂膜染料染色，该样本中79.5%的颗粒因具有膜结构而被该脂膜染料标记，且荧光强度与颗粒粒径呈现正相关。该膜染料不与膜结构结合时无本底荧光信号，嵌入脂膜后荧光信号大大增强，因此无需去除游离染料，与传统膜染料相比使用更为便捷。
近年来，基于外泌体核酸的疾病诊断和治疗的相关研究呈现井喷式发展。通过核酸染料标记的方式可以实现外泌体上核酸的定位分析，包括内部、表面和游离状态的核酸，对核酸的丰度和状态进行综合分析。
结合SYTO 16核酸染料标记及酶处理策略，利用NanoFCM对外泌体中DNA分子的存在形式及分布特征在单颗粒水平进行了详细分析（图7），外泌体运载的DNA分子主要为dsDNA；外部粘附DNA的外泌体粒径相对较小，而内部包裹DNA的外泌体粒径相对较大；经超速离心和SEC方法制备的外泌体样本中存在着大量与囊泡颗粒不相关的游离DNA分子。
NanoFCM除了可实现基于以上多种方法的外泌体质量控制，在载药效率、配体修饰水平等方向亦可实现快速精确检测，为外泌体临床科研及产业化的发展提供助力。如您需要以上相关检测方案或申请样机试用，可扫描下方客服微信二维码联系我们。
参考文献
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