Zeno SWATH DIA新技术二：皮克级超低上样量的稳定蛋白质组鉴定及定量

ZenoTOF™ 7600系统配备的Zeno Trap（Zeno阱）功能激活后，可以使SWATH DIA工作流程中的肽段二级质谱灵敏度提高5-6倍左右，使得蛋白质组学工作流程平台中使用纳克甚至皮克级样品量成为可能。我们应用Zeno SWATH IDA流程，对低进样量K562样品进行分析，使用纳升液相系统进行蛋白质鉴定和定量测试，并且评价了DIA-NN中使用基于自建数据库和非自建库的分析流程。
 

• 液相方法：液相系统：M Class系统（Waters），色谱柱：EV-1106 色谱柱，15 cm x 150 μm，1.9 μm 粒径，流速：300 nL/min，梯度：45min。

  

• 质谱方法：质谱：ZenoTOF™ 7600系统，采集模式：Zeno SWATH DIA，可变窗口数：80个（m/z 400-903），一级累积时间：50毫秒，二级累积时间：18毫秒，源气参数：离子源电压3200 V，温度225°C，Gas1 ：10 psi ，CUR gas ：20 psi。

 

• 数据分析：Zeno SWATH DIA数据使用DIA- NN软件处理，分别使用自建数据库和非自建库流程，自建数据库为之前由OneOmics建立的人细胞裂解液数据库。

 
 
1.  低进样量时蛋白质鉴定和定量数量

在不同进样量时测试蛋白质鉴定和定量数量，可以看到在250 pg进样量时，K562样品可以鉴定到880个蛋白质( FDR<1%)，其中327个蛋白质CV低于20% ( 图1)。随着样品进样量的增加，蛋白质鉴定数量增加，进样5ng时鉴定出3752个蛋白( FDR<1%)，其中2457个蛋白CV低于20%。空白样品按照相同条件进行分析，未检测到蛋白或多肽，说明工作流程可靠性。
   
左图透明柱状图代表global FDR<1%时蛋白质鉴定数量，实心柱状图代表FDR <1%和CV <20%的可定量蛋白质数量。
 
 
2.  采用自建数据库和非自建库时蛋白质鉴定数量对比

使用DIA-NN分别进行基于自建数据库的数据处理，以及直接从人类FASTA文件中生成理论数据库的分析。总体而言，两种数据处理方法蛋白质鉴定的重叠程度很高，使用自建数据库处理的蛋白质鉴定数量略多(约4%)（图2），二者共同鉴定到的蛋白质为819个。
   
 
3.  Zeno SWATH IDA流程稳定性测试

通过比较间隔1个月进样的2组实验来评估低进样量实验的日间重复性，每次实验对相同的K562原液进行稀释，使用Zeno SWATH DIA进行分析。可以看到，在3种低进样量下，观察到相近的蛋白质鉴定数量（图3）。
   
两组实验中，每个进样量样品均进行3次采样。数据在DIA-NN软件中使用基于自建数据库的流程进行数据处理。透明柱状图表示global FDR <1%的蛋白质鉴定数，实心柱状图带表示FDR <1%和CV <20%的可定量蛋白质数。