qPCR扩增曲线有哪些异常的现象和实用对策

RT-qPCR实验中，正常的扩增曲线一般呈S型，Ct值最好在20-30之间。异常的扩增曲线包括曲线无平台期、曲线呈锯齿状和Ct值偏大等现象。扩增曲线有哪些现象。
 
1. Ct值偏大（如Ct值＞30）
1）模板量低或基因表达丰度低，建议增加模板量观察Ct值能否成相应倍数减少。
2）qPCR整个反应条件不适宜或引物设计不当导致扩增效率低，建议通过标准曲线确认扩增效率。
3）扩增产物过长，建议用三步法程序扩增或通过优化引物，扩增产物长度最好不超过300bp。
4）体系中可能存在抑制剂影响酶的活性，建议梯度稀释模板或重新制备纯度更高的模板。

2. 扩增曲线无法达到平台期
基因丰度低、循环数较少，建议增加循环数或选择适合低丰度基因定量的产品。

3.扩增曲线平台期锯齿状
1）RNA纯度低，建议梯度加大模板稀释倍数看优化效果或重新制备高纯度RNA重新实验。
2）仪器长时间未校准，建议定期进行仪器校准保养。

4.有熔解曲线，无扩增曲线
可能是扩增程序设置错误，未进行荧光信号搜集，建议重新实验，增加扩增程序中延伸阶段荧光信号的搜集。

5. 阴性对照有扩增
1）NTC有扩增，可能有以下两种情况：
①Ct＞35，熔解曲线Tm值＜80℃（一般正常qPCR产物，大小在100-300bp之间，熔解曲线Tm大多在80°C以上），可能是引物二聚体导致，可进一步优化引物。
②有Ct值且＜35，表示反应体系被污染，可逐步排除污染源。
2）NRC有扩增
NTC正常，NRC有Ct值，可能是RNA含有gDNA污染。建议用DNase I消化或使用含有gDNA去除的反转录试剂盒。
【注】NTC是指将H2O代替模板的阴性对照反应；NRC是指将未反转录的RNA作为模板的阴性对照反应。

6.复孔重复性差
1）加样误差导致，建议移液器定期校准，另外可通过扩大反应体系或提前配制好预混液优化。
2）模板量低，建议提高模板量，使Ct值落在15-30之间。
3）仪器长时间未校准，建议定期进行仪器校准保养。