Countstar Rigel细胞计数仪在原代细胞检测中的应用

一、原代细胞的简介以及应用 
原代细胞是指从机体内取出后立即培养的细胞，原代细胞不仅广泛应用于分子、细胞生物学和生物医学的基础研究，如蛋白质组学、基因组学、细胞株(系)研究等，还可应用于当今热门的生物医药产业如药物筛选、药物代谢和毒理研究、癌症药物的研究等。原代细胞在生物医药领域有不可替代性作用，市场前景广阔。
 
二、原代细胞的提取方法
1、悬浮细胞的分离方法
组织材料若来自血液、羊水、胸水或腹水的悬液材料，最简单的方法是采用1000r/min的低速离心10分钟，以避免挤压或机械损伤细胞，离心沉淀用无钙、镁PBS洗两次，用培养基洗一次后，调整适当细胞浓度后再分瓶培养。.
 
2、实体组织材料的分离方法
（1）机械分散法
所取材料若纤维成分很少，如脑组织，部分胚胎组织可采用剪刀剪切、用吸管吹打分散组织细胞或将已充分剪碎分散的组织放在注射器内（用九号针），使细胞通过针头压出，或在不锈钢纱网内用钝物压挤（常用注射器钝端）使细胞从网孔中压挤出。
（2）消化分离法
a、酶消化分离法
酶消化分离法常采用胰蛋白酶和胶原酶
（a）胰蛋白酶分散技术
胰蛋白酶（简称胰酶）是广泛应用的消化剂。胰蛋白酶是一种胰脏制品，对蛋白质有水介作用，主要作用于赖氨酸或精氨酸相连接的肽键，使细胞间质中的蛋白质水介而使细胞分散开。胰蛋白酶对细胞的作用，取决于细胞类型、酶的活力、配制的浓度、消化的温度、无机盐离子、pH以及消化时间的长短等。
（b）胶原酶（Collagenase）消化法
适于消化纤维性组织、上皮组织以及癌组织，它对细胞间质有较好的消化作用。可用PBS和含血清的培养液配制，即操作简便又可提高细胞成活率，最终浓度0.1~0.3mg/mL.
b、非酶消化法（EDTA消化法）
常用不含钙、镁离子的PBS配成0.02%的工作液，对一些组织，尤其是上皮组织分散效果好。
 
三、原代细胞的计数
对于刚提取出来的原代细胞，用于后续试验中，精准的细胞计数是必不可少的，虽然台盼蓝染色是常用的活细胞的计数方法，但是台盼蓝计数的缺点在于区分原代细胞内的杂质和碎片，对于原代细胞来说，台盼蓝染色计数出来的浓度与活率与真实值相差的比较大，对于后续的实验有影响(图1)。
 

利用Countstar双荧光AO/PI的方法检测可以有效避免杂质和碎片的影响，从而对细胞浓度和活率进行准确的计数。在Countstar Rigel系统中，具有完整细胞膜的有核细胞染绿色荧光并被计为活细胞，而具有受损细胞膜的有核细胞染红色荧光并被计为死细胞，对于一些无核杂质和碎片不发光，Countstar Rigel可以把它们忽略掉。(图2、图3)