高分子纳微球在工程疫苗中的新应用（上）

摘要:随着新发、突发重大传染病以及恶性肿瘤等疾病防控需求的增加，以经验开发为主的传统疫苗体系亟待更新。高分子纳微球因其独特的理化优势，成为生物医药递送领域研究和关注的焦点。但是如何对纳微球体系进行合理化设计和工程化整合是疫苗递送系统开发中遇到的重要挑战。本团队20年来在高分子纳微球制备和应用方面进行了系统性研究，并提出纳微球为“底盘”(Chassis)和亚单位疫苗共组装成先进疫苗的策略，发现和创制了高分子纳微球新功能，阐明了其在细胞/黏膜免疫中的重要作用机理。本专论结合国内外研究现状，围绕上述研究工作，介绍了工程化疫苗底盘按需设计的思路和参考机制，同时也探讨了其在生物医药领域的发展前景。

基于高分子纳微球发展新型给药系统成为生物医药领域研究和关注的焦点[1~3]。目前已有数种药物的长效缓释/控释纳微球制剂上市，为全球患者带来福音。一方面，使用纳微颗粒封装半衰期短的多肽/蛋白药物(如Bydureon艾塞那肽)，经过微球缓慢降解释放，可大幅度延长药物体内作用时间. 另一方面，通过颗粒装载抗癌药物(如Doxil阿霉素)，可借助纳米尺寸实现药物在肿瘤靶部位的蓄积，减少毒副作用。 虽然纳微球包封技术已经发展了近70年，但这一领域在疫苗递送方面的研究相对滞后. 直至1979年才有研究者提出使用聚乙烯醇共聚物颗粒(~ 1 mm)延缓抗原释放[4]，减少疫苗接种次数. 经过30年发展，进入临床实验的纳微球佐剂疫苗品种仍屈指可数. 尤其是针对新发、突发重大传染病以及恶性肿瘤等疾病，仅具备缓释性能或者纳微米尺寸，将无法满足相应疫苗的防控需求，亟须对纳微球体系进行合理化设计和工程化整合，获得高效的免疫应答水平。

理论上，球型颗粒同自然界中的病原性细菌、真菌、病毒等尺寸或维度相近[5]，更容易被机体识别为外源性物质，具有激发机体免疫应答等多重潜力. 但由于人工制备的生物可降解高分子纳微球难以像生物颗粒那样实现对其尺寸和功能的精准控制，纳微球引发的免疫学效应及相关机制仍不清晰，相应疫苗的设计和开发受到阻碍. 为突破当前疫苗研发的壁垒，我们基于均一高分子纳微球制备和应用方面的工作基础，提出构建智能纳微球材料，将其作为工程化疫苗“底盘”(Chassis)的策略(图1). 通过对底盘的智能性设计和新功能创制，模拟病原体尺寸和性质，将亚单位疫苗抗原组装在底盘上，制备出先进工程疫苗(复合病毒样颗粒). 底盘可发挥病原体骨架和成分的双重作用，不仅能提高疫苗的稳定性，而且可以提升体液/细胞双重免疫应答，满足新型疫苗应答等需求，全面而深入地揭示免疫应答增强的关键因素和机理. 本专论将对本团队基于均一纳微球构建疫苗体系的相关研究进行总结，重点介绍工程化疫苗底盘按需设计的思路和参考机制。

Fig. 1 New strategy for advanced engineering vaccine by assemblingthe Chassis (micro/nanoparticles) and the components (antigens)

1.  纳微球均一性的重要性

高分子纳微球的粒径、形貌、性能可用多种方法来实现调控，尤其是从单体(如苯乙烯)制备聚合物微球时，其物化性质的控制方法多种多样[6]. 但是，对于能用于人体内的生物可降解或兼容性好的高分子材料(聚乳酸系列、壳聚糖系列)，主要以聚合物为起始原料制备微球，其制备以及粒径和形貌控制是长期以来的难点.

传统机械搅拌、均相乳化、超声等制备方法制备高分子微球条件剧烈，如在制备底盘的同时负载疫苗，会造成疫苗失活；且已有生物可降解高分子功能较单一，无法像合成材料那样在合成过程中赋予新的功能，必须采用新的策略赋予其智能性才能获得有效的疫苗底盘和先进疫苗. 最重要的是，传统制备方法由于剪切场不均一和Oswald熟化现象，无法形成均一液滴，造成颗粒均一性和稳定性差.

利用不均一颗粒作为疫苗载体，不仅降低了实验结果的可靠性，也影响了生物利用度和成药性. 一方面，在进行免疫学效应研究时，抗原在体内分布不规律、释放重复性差，实验结果的波动性会被显著放大，导致结果出现不一致甚至截然相反的现象[7,8]，难以系统地研究粒径、形貌对免疫学效应的影响. 例如，Ying等利用喷雾干燥法制备出PLGA微米颗粒，吞噬率为61%，但由于微球尺寸不均一(粒径大小从400 nm至4 μm不等)，从而影响了对该微球作为疫苗载体潜力的判断. 另一方面，当进行到纳微球制剂逐级放大阶段时，制备和粒径控制问题更加突出，如果均一性难以得到保障，势必会引起批次间的颗粒性质出现差异，成药性差. 虽然经过筛分可以得到粒径均一的纳微米颗粒，但是这一过程繁琐复杂，耗时长，不仅浪费人力和财力，也会造成药物和原料的浪费. 而且，对于多糖等黏度高的体系，即使筛分也难以获得纳米-至微米级的小粒径颗粒.

2.  均一纳微球制备新过程

粒径均一微球制备是工程化疫苗底盘构建的基础，需要克服多重挑战. 针对该难题，我们创建了预分散-快速膜乳化过程，可以实现纳米到微米的粒径均一可控，为底盘和先进疫苗的设计和应用奠定了基础[9]. 该方法主要原理如下：在优化的压力下将传统方法制备的高分子预乳液压过具有一定长度和曲率的均一膜孔，借助弯曲膜孔的均匀剪切作用等克服界面张力，将预乳液分散成均一小液滴. 不同尺寸的均一纳微颗粒可通过选择特定孔径的微孔膜，制得不同尺寸的均一乳液(油包水、水包油、水包油包水等)，再经物理或化学方法固化交联后获得. 在上述预分散-快速膜乳化法的发展过程中，我们发现预乳液粒径、黏度、过膜压力、膜弯曲度以及厚度是影响高分子纳微球制备和粒径控制的关键因素，建立应力-乳液体系-微孔膜的相关性理论，并进一步将该方法拓展至高黏度聚合物体系[10]，克服了传统方法难以制备的瓶颈. 目前，使用膜乳化法已成功制备聚乳酸、壳聚糖、琼脂糖、蒲甘聚糖和海藻酸盐等十余种生物可降解高分子纳微球和复合纳微球，粒径在100 nm至30 μm间均一可控，粒径分布系数CV < 15，远优于传统方法(CV值通常大于50%). 该过程能耗低且易放大，相关微球作为蛋白质分离介质以及多种规模的膜乳化设备均已商品化，为生物颗粒剂型的制备和进一步应用提供了简便、高效和切实可行的手段(图2).

Fig. 2 The process and instrumentsof membrane emulsification and its resultant particles (The fluorescentparticle panel was reprinted with permission from Ref.[20], Copyright (2008)WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim)

基于均一纳微球的制备方法，后续相继发现和创制了生物可降解纳微颗粒的多种新功能(如自发荧光[11]、pH敏感[12,13]、多级有序[14]等)和不同理化特性(包括尺寸[15~17]、形貌[18~22]和电荷[23~26]等). 颗粒的均一性保证了定量研究粒径/物化等性质对免疫效果/机理影响的准确性，而颗粒的新功能为体内分布代谢的研究以及给药和免疫疗效的提升提供新的策略. 两方面优势结合，不仅可以满足生化分离介质[27,28]和蛋白药物缓控释[29~31]等多个方向的效用评价和机理研究，还为工程疫苗构建奠定了坚实基础.

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关于森辉

中科森辉微球技术（苏州）有限公司于2014年4月设立，位于苏州工业园区的苏州纳米城，是一家集研发、生产、销售于一体的知识驱动型高科技公司，致力为生命科学、生物技术等领域提供国际领先的自主产品以及“一体化”解决方案。公司拥有一支卓越的研发团队和一系列自主知识产权的核心技术。技术团队来自中国科学院，核心灵魂是我国生物材料和生化分离领域的知名专家马光辉研究员和苏志国研究员，以及十多位具有博士学位的技术骨干。

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