辅料、贮存、以及配方条件对注射用蛋白质药物稳定性的影响

为什么蛋白质与包装容器之间的相互作用很重要？
在制造、存储和运输过程中，注射用蛋白质药物会接触到金属、玻璃、油和聚合物等多种表面和材料。从最初的蛋白合成用的不锈钢容器，到最后注射入人体前的玻璃针管都会涉及。蛋白质固有的表面活性可导致它们与表面相互作用，从而产生可能的变性和后期聚集。这种聚集会产生与安全相关的问题，例如不良的免疫反应，不良的交叉反应或功效丧失。
   
辅料蛋白质保护机制
辅料（赋形剂）是蛋白质制剂的添加剂，有助于稳定蛋白质的结构，并最大程度地减少潜在的有害聚集、级联反应。它们的范围从简单的缓冲液到更复杂的成分如氨基酸，糖，表面活性剂和抗氧化剂等。表面活性剂或表面活化物质，在决定蛋白质通过潜在的三种可能机制与表面相互作用中起主要作用（图1）：
 

1. 共配制：药物制剂中的表面活性剂/活化物质在蛋白质分子上形成保护层，从而防止它们粘附到容器表面上。
2. 表面相互作用：表面活性剂/活化物质在容器表面形成保护层并抑制蛋白质吸附。
3. 蛋白质相互作用：表面活性剂/活化物质与吸附的蛋白质相互作用并将其从表面去除。

  图1：代表表面活性剂/活化物质保护药物蛋白质的三种可能机理的示意图：共配制，表面相互作用和蛋白质相互作用。
 
QSense QCM-D如何帮助量化蛋白质表面吸附?
表面敏感的QSense耗散型石英晶体微天平（QCM-D）技术可用于评估蛋白质如何与生产容器，加工材料（例如过滤器），储存容器或运输装置相互作用。QCM-D是一种基于石英压电效应传感器的表面技术，可实时监控表面的纳米/纳克级变化。
 
由于可以在QCM-D传感器上准备多种不同的表面材料，轻松研究各种不同材料的性质便成为了可能。该技术可以量化与表面相互作用的蛋白质的量（质量和厚度），以及由于蛋白质溶液和QCM-D传感器之间的相互作用而导致的结构（粘弹性）特性变化。可以评估赋形剂的存在及其他配方条件例如浓度，pH或缓冲液类型等等，对吸附特性的影响。类似如温度波动，pH值变化或搅拌之类的压力同样可以很容易被探测到。
 
QSense提供了多种现成的传感器表面，可模仿各种存储罐，过滤器和运输表面材料。QSense可提供定制的表面，以满足特定的工业需求。下面是瑞典百欧林当前提供的与制药相关的QCM-D传感器列表：
 
制药相关的QCM-D传感器列表：

塑料包装	包袋
聚丙烯，PP 聚氯乙烯，PVC 聚对苯二甲酸乙二醇酯，PET 聚甲基丙烯酸甲酯，PMMA	环烯烃聚合物，COP 环烯烃共聚物，COC
玻璃容器	过滤材料
硼硅酸盐玻璃（小瓶，注射器，实验室用具） 钠钙玻璃	聚偏二氟乙烯PVDF 聚四氟乙烯，PTFE 聚碳酸酯，PC 聚醚砜，PES 聚对苯二甲酸乙二醇酯改性的PET-G
预填装注射器	其他相关材料
聚二甲基硅氧烷 PDMS 硅油	聚苯乙烯 纤维素 不锈钢 尼龙 聚氨酯 醋酸纤维素 聚丙烯腈

注：可根据要求定制传感器表面。
 
演示案例：如何使用QCM-D量化蛋白质-表面相互作用
在本案例研究中，存在/不存在药物制剂聚山梨酯20（PS20）的条件下，模型蛋白溶菌酶被吸附在聚偏二氟乙烯（PVDF），聚苯乙烯（PS），聚四氟乙烯（PTFE）和不锈钢上。
 
PVDF通常用作蛋白质溶液的过滤材料。PS用来模仿诊断仪器和一次性实验室用具如培养皿，组织培养容器，烧瓶和移液器。PTFE由于出色的化学相容性和耐热性，已用于各种应用包括过滤器，阀门，配件，密封件，垫圈，储罐，容器和管道。不锈钢来模拟生产容器表面。
 
在PBS缓冲液中制备10mg/mL（1％）的溶菌酶，0.05％聚山梨酯20（PS20）（V/V）。使用蠕动泵将溶液以100µL/min的流速泵入QSense QCM-D仪器中。
 
在每种类型的表面上进行了以下4组实验（括号定义吸附机理）：
 

1. PBS基线→溶菌酶+PS20混合物的吸附→PBS缓冲液洗涤（共配制）
2. PBS基线→PS20→溶菌酶→PBS缓冲液洗涤（表面相互作用）
3. PBS基线→溶菌酶→PS20→PBS缓冲液洗涤（蛋白质相互作用）
4. PBS基线→溶菌酶→PBS缓冲液洗涤（对照）

 
QCM-D实时监控两个参数：频率（f）和能量耗散（D）。频率与质量变化有关：频率下降表示物质吸附。耗散与吸附物质的柔软度或粘弹性有关：耗散增加表示吸附物质较为柔软。耗散与频率D/f的比值可以提供与蛋白质变性有关的有价值信息。
 
吸附表面的影响：
结果表明，表面组分显著影响蛋白质的吸附量（图2）。在亲水性不锈钢上吸附量最高，而在疏水性PTFE上吸附量最低（图2c和2d）。
 
表面活性剂的影响：
当PS20存在时，无论是其在溶液中还是预先吸附在表面上，都大大降低了PVDF和聚苯乙烯表面上的蛋白质吸附（图2a和2b）。相反地，在PTFE和不锈钢表面上并未观察到PS20的显著吸附（图2c-2d）。
 
当将表面活性剂混合到药物制剂中（共配制）时，其表面保护作用类似于表面上预先吸附的表面活性剂层（表面相互作用）。通过PS20（蛋白质相互作用）对吸附的蛋白质层进行后处理不会导致明显的蛋白质去除。
 
耗散与频率比值（D/f）：
（D / f）在图2中显示为红色“x”，提供了有关吸附物质柔软度的信息。吸附质量的任何结构变化，例如由于添加表面活性剂，会改变该比例的变化。在不锈钢表面上，所有条件下D / f均保持恒定且较低，这表明吸附的物质是刚性的，并且不受表面活性剂的影响（图2d）。由于可能变性的蛋白质构型，已经形成了刚性结构。在聚合物表面上，当存在PS20时，D / f增加（图2a，2b和2c），表明在表面活性剂存在下，这些表面上的吸附物质相对较软。
  图2：在（a）PVDF，（b）聚苯乙烯，（c）PTFE，（d）不锈钢上存在/不存在聚山梨酯20的情况下，溶菌酶吸附的频率（质量）变化和D / f值（3倍频的D / f）。
 
柱状图的总高度代表缓冲液洗涤之前的总质量吸附，较浅的阴影部分表示缓冲液洗涤后被洗去的质量，较深的阴影部分表示缓冲液洗涤后的残留质量。（数据来自瑞典百欧林。）
可以发现聚山梨酯20和蛋白质保护作用机制取决于所讨论的表面材料。这个例子说明了表面活性剂如何通过在蛋白质和材料表面之间形成保护性屏障来保护蛋白质不与表面相互作用。该数据还可能揭示当吸附到特定表面（如不锈钢）上时蛋白质会变性，以及进一步表面相互作用时可能发生聚集的风险。
 
使用QSense QCM-D研究医药相关TOP 5的文章
许多出版物中已经报道了使用QCM-D技术在医药领域中的相关研究。在这里，我们列出了TOP5文章，供读者参考。

1. J. Li et al. “Mechanistic Understanding of Protein-Silicone Oil Interactions” Pharm Res 2012, 29 (6), 1689-1697. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22350802
2. S. Zheng et al. “Particle Characterization for a Protein Drug Product Stored in Pre-Filled Syringes Using Micro-Flow Imaging, Archimedes, and Quartz Crystal Microbalance with Dissipation” The AAPS Journal 2017, 19 (1), 110-116. https://link.springer.com/article/10.1208/s12248-016-9983-1
3. A. Oom et al. “Surface interactions of monoclonal antibodies characterized by quartz crystal microbalance with dissipation: Impact of hydrophobicity and protein self‐interactions” J Pharm Sci 2011, 101(2): 519-529 https://doi.org/10.1002/jps.22771
4. Wiseman ME, et al. “Antibody adsorption and orientation on hydrophobic surfaces” Langmuir 2012 28:1765–1774. https://pubs.acs.org/doi/10.1021/la203095p
5. J. Li et al. “Adsorption of polypropylene oxide-polyethylene oxide type surfactants at surfaces of pharmaceutical relevant materials: effect of surface energetics and surfactant structures” Phar Dev Technol 2019 24:70-79 https://www.tandfonline.com/doi/abs/10.1080/10837450.2018.1425431