如何实时监测小鼠肿瘤
什么是（IVIS, in vivo Imaging system）
IVIS即小动物活体成像体统，通过一套非常灵敏的光学检测仪器，主要基于生物发光（Luc等标记）或荧光（GFP等标记）原理直接监控活体动物体内组织、细胞或分子等行为。
如下图：左：IVIS Lumina III 小动物活体成像系统，包括一个高度灵敏的CCD相机及成像暗箱和成像软件，右：对应荷瘤小鼠放置暗箱后的原理图。
IVIS Lumina III成像系统（来自PerkinElmer） Luc-细胞的活体成像模式图[1]
IVIS主要包括生物发光或荧光原理，在肿瘤研究中基于生物发光的荧光素酶(Luciferase, Luc)基因标记细胞，更为常用。
为什么肿瘤研究主要用Luc标记的生物发光呢？
主要在于生物发光可获得更加真实可靠的数据。荧光信号虽远远强于生物发光，但非特异性荧光产生的背景噪音使其信噪比远远低于生物发光。这些背景噪音造成荧光成像的灵敏度较低。从目前发表的高水平文章来看，大部分还是应用生物发光的方法来研究活体动物体内成像。下面我们就具体介绍。
基于生物发光的IVIS监测肿瘤的优势
1. 能够实时监测肿瘤生长和转移
我们知道卡尺测量只限于皮下肿瘤，无法监测体内原位或转移肿瘤。最传统的方法即一次性获得很多荷瘤小鼠，每一阶段处死一批，取出小鼠体内肿瘤获得统计数据。这明显是很愚笨低效的办法。而IVIS可以长时间并阶段性地、无创伤地定量检测小鼠原位瘤、转移瘤及自发瘤。
如下图：荧光标记的人乳腺癌细胞株MDA-MB231-luc，注射到小鼠第四对乳房垫，构建乳腺癌原位模型。利用IVIS可以每隔几天对小鼠体内肿瘤进行观察和统计。
MDA-MB231-luc在裸鼠体内成像图[2]
2. IVIS相比皮下测量，更加灵敏
如卡尺测量是当肿瘤组织长到绿豆大小才开始统计，对于之前这段时间，我们的信息是空白的，如细胞是否生长或者坏死；又如，当肿瘤组织长到一定阶段，尽管体积未变化，但是肿瘤细胞已出现了坏死[3]。
如下图：辉瑞上市的抗癌药物Sutent，卡尺测量发现药物处理组的PC-3M-Luc 皮下肿瘤体积仍在缓慢生长，但IVIS却发现，药物组光学信号显著降低，即表明细胞已经死亡。IVIS结果，使得辉瑞顺利通过FDA认证[4]。
辉瑞上市药物Sutent的临床前结果[4]
综上所述，IVIS因可获取更加准确直观的结果，且操作简单快捷，尽管才发展几年，但已广泛用于抗肿瘤药物研发及肿瘤机理研究。下面就一起来学习一下IVIS系统的操作。
如何用IVIS进行肿瘤监测
小动物活体成像，基本原理是利用软件及成像系统，将Luc标记的细胞在小鼠体内荷瘤，当给小鼠注射底物荧光素(luciferin)时，荧光素酶可以催化luciferin氧化成oxyluciferin，氧化过程中会发出生物荧光，几分钟内就可获得统计数据。
基本步骤如下图：
Luc标记的IVIS操作步骤
注意事项：
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稳转Luc细胞株必须在体外检测稳定表达后，才可以用于体内实验；
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底物浓度一般为150mg/kg; 如一只8周雄性裸鼠约20g，那么一只小鼠需要3mg底物；一般用无菌PBS溶解。
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虽然IVIS上带有气麻机，但是一般还是先将小鼠气麻好，再放置于机器；
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在使用软件时，成像前需要设置软件的多个参数，如小鼠成像时间（3-5min）、荧光最大值及最小值、温度及建立不同组的文件夹等。
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因为成像的小鼠图片后续可能要用于文章发表等，所以一定要摆放整齐。
详细操作步骤可以参考JOVE的视频地址：https://www.jove.com/video/1210/
常见问题解答
1. 一般细胞注射多久，可以上机成像？
一般在注射细胞30分钟后利用IVIS监测细胞位置及数量，并且马上进行分组。
2. 刚注射的Luc细胞，IVIS上看不到发光图片，有哪些原因？
考虑Luc细胞本身问题；机器参数设置是否有问题，如我们可以在软件上设置荧光最大值和最小值的范围，若最小值较大，会造成看不到发光图片。
3. 注射的Luc细胞，多久之内可以观察成像？
荧光素脂溶性非常好, 很容易透过血脑屏障。一般腹腔注射10min后，即可麻醉后上机；一次荧光素能保持小鼠体内荧光素酶标记的细胞发光30-45min，所以操作尽快完成。
数据分析及应用
1. 抗肿瘤药物研发
如上图中辉瑞上市的抗癌药物Sutent，通过IVIS可以直接快速地测量肿瘤的生长和转移，从而实时观测和评估药物的效果。
2. 也可以用于癌症分子机理的研究
将癌症相关的目的基因和荧光素酶标记，整合一起构建共表达载体，通过发光信号，反应基因表达情况，进而推测基因与肿瘤发展的关系。
如下图：研究者将一个荧光素酶基因质粒与带有致癌基因ras、四环素反式激活因子tTA (tet-off)及四环素依赖性p53 shRNA的逆转录病毒表达载体共转染成肝细胞后，接种于小鼠肝脏。结果显示，当p53的表达被shRNA抑制时，生物发光观测到的肿瘤信号逐渐增强；当用强力霉素诱导表达后，信号减弱，进而说明p53的表达能够抑制肿瘤的生长[5]。
IVIS观测p53基因表达下降或上升对于肝癌发生的作用 [5]
IVIS由于能够实时追踪肿瘤在体内的位置及生长情况，并且快捷地提供准确的数据，已应用于肿瘤研究多个领域。所以这是一项非常重要的监测手段。希望看了我们的文章，能给你带来帮助。有任何问题，欢迎留言讨论！
参考文献
[1] https://www.jove.com/video/1210/
[2] Zhang T, Chen Y, Li J, et al. Antitumor action of a novel histone deacetylase inhibitor, YF479, in breast cancer.[J]. Neoplasia, 2014, 16(8): 665-677.
[3] Lim, E., Modi, K.D., Kim, J. In vivo Bioluminescent Imaging of Mammary Tumors Using IVIS Spectrum. J. Vis. Exp. (26), e1210, doi:10.3791/1210 (2009).
[4] Mendel DB, Laird AD, Xin X, et al. In vivo antitumor activity of SU11248, a novel tyrosine kinase inhibitor targeting vascular endothelial growth factor and platelet-derived growth factor receptors: determination of a pharmacokinetic/pharmacodynamic relationship. Clin Cancer Res. January 2003;9(1):327-337.
[5] Xue W, Zender L, Miething C, et al. Senescence and tumour clearance is triggered by p53 restoration in murine liver carcinomas[J]. Nature, 2007, 445(7128): 656-660.
