真菌DNA和RNA提取方法
真菌DNA和RNA提取方法
一、真菌DNA的提取(方法一)
1.实验试剂
(1)DNA提取液:0.2M Tris-HCl(pH 7.5),0.5M NaCl,0.01M EDTA,1％SDS
(2)3M NaAc
(3)TE:10 mmol/L Tris-HCl pH8.0,1 mmol/L EDTA
(4)酚(pH8.0):氯仿:异戊醇(25:24:1)
(5)氯仿:异戊醇(24:1)
(6)异丙醇
(7)无水乙醇
(8)75%乙醇
(9)RNaseA
2.实验步骤
(1)取真菌菌丝0.5g, 在液氮中迅速研磨成粉
(2)加入4mL提取液,快速振荡混匀
(3)加入等体积的4mL的氯仿:异戊醇(24:1),涡旋3～5min(此处是粗提没有加酚,可以节约成本)
(4)1000rpm,4℃,5min
(5)上清用氯仿:异戊醇(24:1)再抽提一次(10,000rpm,4℃离心5min)
(6)取上清,加入2/3倍体积的-20℃预冷异丙醇或2.5倍体积的无水乙醇沉淀, 混匀, 静置约30 min
(7)用毛细玻棒挑出絮状沉淀,用75%乙醇反复漂洗数次,再用无水乙醇漂洗1次,吹干,重悬于500ul TE中
(8)加入1ul RNaseA (10mg/mL),37℃处理1h
(9)用酚(pH8.0):氯仿:异戊醇(25:24:1)和氯仿:异戊醇(24:1)各抽提1次(10,000rpm,4℃离心5min)
(10)取上清,1/10V 3M NaAc,2.5V体积的无水乙醇,-70℃沉淀30min以上
(11)沉淀用75%乙醇漂洗,风干,溶于200ul TE中,-20℃保存备用
二、真菌DNA的提取(方法二)
1.真菌菌丝0.5-1g,在液氮中迅速研磨成粉
2.加入3mL 65℃预热的DNA提取缓冲液,快速振荡混匀65℃水浴30min,期间混匀2-3次
3.加入1mL 5M KAc,冰浴20min
4.氯仿:异戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃离心5min)
5.取上清,加入2/3倍体积的-20℃预冷异丙醇,混匀,静置约30 min
6.用毛细玻棒挑出絮状沉淀,用75%乙醇反复漂洗数次,再用无水乙醇漂洗1次,吹干,重悬于500ul TE中
7.加入1ul RNaseA(10mg/mL),37℃处理1h
8.用酚(pH8.0):氯仿:异戊醇(25:24:1)和氯仿:异戊醇(24:1)各抽提1次(10,000rpm,4℃离心5min)
9.取上清,1/10V 3M NaAc,2.5V体积的无水乙醇,-70℃沉淀30min以上
10.沉淀用75%乙醇漂洗,风干,溶于200ul TE中,-20℃保存备用
DNA提取缓冲液:100mM Tris-HCl(pH8.0),20mM EDTA(pH8.0),1.5M NaCl,2% CTAB(W/V),4% PVP40(W/V)和2%巯基乙醇(V/V),PVP和巯基乙醇使用前加入5M KAc
方法一和二,是大同小异.主要是DNA提取液配方不一样！成本也不一样！
三、真菌菌丝的总RNA的提取
1.实验试剂
(1)RNA提取缓冲液(CTAB):2% CTAB(W/V),2% 聚乙烯吡咯烷酮PVP(W/V),100mM Tris-HCl(pH8.0,DEPC处理的水配置),25mM EDTA,0.5g/L 亚精胺Spermidine,2.0M NaCl,2%巯基乙醇(V/V,使用前加入).由于在高温灭菌条件下,Tris-HCl要和DEPC发生反应,所以配RNA提取缓冲液时直接用DEPC 处理的水配制即可
(2)SSTE:1 M NaCl,0.5% SDS(W/V),10mM Tris-HCl pH8.0,1.0mM EDTA
(3)10M LiCl 直接用蒸馏水配10M LiCl,加1‰的DEPC过夜后,高温灭菌
(4)3M NaAc
(5)氯仿:异戊醇(24:1)
(6)酚(pH4.5):氯仿:异戊醇(25:24:1)
(7)DEPC处理水 用1‰的DEPC处理蒸馏水过夜,高温灭菌
(8)无水乙醇;70%酒精
2.实验步骤
(1)实验开始前将RNA提取液于65℃水浴锅中预热,离心管中加入ME(巯基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)
(2)取约0.8g菌丝体(液体培养获得的菌丝用真空抽滤即可！固体培养就更好说了),在液氮中迅速磨成精细粉末,装入50mL离心管,按1g材料8mL的量加入预热的RNA提取液,颠倒混匀
(3)65℃水浴3-10 min,期间混匀2-3次
(4)加入等体积的酚(注意是酸酚pH4.5):氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(5)取上清,等体积的氯仿:异戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(6)加入1/4V体积10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或过夜)
(7)10,000rpm,4℃离心20min
(8)弃上清,用500ul SSTE溶解沉淀
(9)酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提两次,氯仿:异戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)
(10)加2V体积的无水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上
(11)12,000rpm,4℃离心20 min
(12)弃上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥
(13)加200ul的DEPC处理水溶解
(14)用非变性琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计扫描检测RNA的质量
(在抽提过程中,若蛋白质含量或其它的杂质还较多,可以增加抽提次数)
注意：提取RNA请尽量在低温下操作,如果条件不容许,在室温下操作的时间要尽可能的短.
北京百欧博伟生物技术有限公司（biobw）是北京的一家专业于生物技术的研究与广泛运用及推广的高科技公司，位于北京企业林立的丰台区造甲街，生物技术推广及运用早于2011年开始，成立公司于2013年一月。本公司主要提供色谱耗材、色谱仪器、固相萃取装置、化学试剂、样品瓶、氘灯、标准品、微生物技术、菌种保藏服务以及ATCC产品代理等产品及服务。
http://www.biobw.com/
一、真菌DNA的提取(方法一)
1.实验试剂
(1)DNA提取液:0.2M Tris-HCl(pH 7.5),0.5M NaCl,0.01M EDTA,1％SDS
(2)3M NaAc
(3)TE:10 mmol/L Tris-HCl pH8.0,1 mmol/L EDTA
(4)酚(pH8.0):氯仿:异戊醇(25:24:1)
(5)氯仿:异戊醇(24:1)
(6)异丙醇
(7)无水乙醇
(8)75%乙醇
(9)RNaseA
2.实验步骤
(1)取真菌菌丝0.5g, 在液氮中迅速研磨成粉
(2)加入4mL提取液,快速振荡混匀
(3)加入等体积的4mL的氯仿:异戊醇(24:1),涡旋3～5min(此处是粗提没有加酚,可以节约成本)
(4)1000rpm,4℃,5min
(5)上清用氯仿:异戊醇(24:1)再抽提一次(10,000rpm,4℃离心5min)
(6)取上清,加入2/3倍体积的-20℃预冷异丙醇或2.5倍体积的无水乙醇沉淀, 混匀, 静置约30 min
(7)用毛细玻棒挑出絮状沉淀,用75%乙醇反复漂洗数次,再用无水乙醇漂洗1次,吹干,重悬于500ul TE中
(8)加入1ul RNaseA (10mg/mL),37℃处理1h
(9)用酚(pH8.0):氯仿:异戊醇(25:24:1)和氯仿:异戊醇(24:1)各抽提1次(10,000rpm,4℃离心5min)
(10)取上清,1/10V 3M NaAc,2.5V体积的无水乙醇,-70℃沉淀30min以上
(11)沉淀用75%乙醇漂洗,风干,溶于200ul TE中,-20℃保存备用
二、真菌DNA的提取(方法二)
1.真菌菌丝0.5-1g,在液氮中迅速研磨成粉
2.加入3mL 65℃预热的DNA提取缓冲液,快速振荡混匀65℃水浴30min,期间混匀2-3次
3.加入1mL 5M KAc,冰浴20min
4.氯仿:异戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃离心5min)
5.取上清,加入2/3倍体积的-20℃预冷异丙醇,混匀,静置约30 min
6.用毛细玻棒挑出絮状沉淀,用75%乙醇反复漂洗数次,再用无水乙醇漂洗1次,吹干,重悬于500ul TE中
7.加入1ul RNaseA(10mg/mL),37℃处理1h
8.用酚(pH8.0):氯仿:异戊醇(25:24:1)和氯仿:异戊醇(24:1)各抽提1次(10,000rpm,4℃离心5min)
9.取上清,1/10V 3M NaAc,2.5V体积的无水乙醇,-70℃沉淀30min以上
10.沉淀用75%乙醇漂洗,风干,溶于200ul TE中,-20℃保存备用
DNA提取缓冲液:100mM Tris-HCl(pH8.0),20mM EDTA(pH8.0),1.5M NaCl,2% CTAB(W/V),4% PVP40(W/V)和2%巯基乙醇(V/V),PVP和巯基乙醇使用前加入5M KAc
方法一和二,是大同小异.主要是DNA提取液配方不一样！成本也不一样！
三、真菌菌丝的总RNA的提取
1.实验试剂
(1)RNA提取缓冲液(CTAB):2% CTAB(W/V),2% 聚乙烯吡咯烷酮PVP(W/V),100mM Tris-HCl(pH8.0,DEPC处理的水配置),25mM EDTA,0.5g/L 亚精胺Spermidine,2.0M NaCl,2%巯基乙醇(V/V,使用前加入).由于在高温灭菌条件下,Tris-HCl要和DEPC发生反应,所以配RNA提取缓冲液时直接用DEPC 处理的水配制即可
(2)SSTE:1 M NaCl,0.5% SDS(W/V),10mM Tris-HCl pH8.0,1.0mM EDTA
(3)10M LiCl 直接用蒸馏水配10M LiCl,加1‰的DEPC过夜后,高温灭菌
(4)3M NaAc
(5)氯仿:异戊醇(24:1)
(6)酚(pH4.5):氯仿:异戊醇(25:24:1)
(7)DEPC处理水 用1‰的DEPC处理蒸馏水过夜,高温灭菌
(8)无水乙醇;70%酒精
2.实验步骤
(1)实验开始前将RNA提取液于65℃水浴锅中预热,离心管中加入ME(巯基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)
(2)取约0.8g菌丝体(液体培养获得的菌丝用真空抽滤即可！固体培养就更好说了),在液氮中迅速磨成精细粉末,装入50mL离心管,按1g材料8mL的量加入预热的RNA提取液,颠倒混匀
(3)65℃水浴3-10 min,期间混匀2-3次
(4)加入等体积的酚(注意是酸酚pH4.5):氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(5)取上清,等体积的氯仿:异戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(6)加入1/4V体积10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或过夜)
(7)10,000rpm,4℃离心20min
(8)弃上清,用500ul SSTE溶解沉淀
(9)酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提两次,氯仿:异戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)
(10)加2V体积的无水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上
(11)12,000rpm,4℃离心20 min
(12)弃上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥
(13)加200ul的DEPC处理水溶解
(14)用非变性琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计扫描检测RNA的质量
(在抽提过程中,若蛋白质含量或其它的杂质还较多,可以增加抽提次数)
注意：提取RNA请尽量在低温下操作,如果条件不容许,在室温下操作的时间要尽可能的短.
北京百欧博伟生物技术有限公司（biobw）是北京的一家专业于生物技术的研究与广泛运用及推广的高科技公司，位于北京企业林立的丰台区造甲街，生物技术推广及运用早于2011年开始，成立公司于2013年一月。本公司主要提供色谱耗材、色谱仪器、固相萃取装置、化学试剂、样品瓶、氘灯、标准品、微生物技术、菌种保藏服务以及ATCC产品代理等产品及服务。
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