血液谷胱甘肽过氧化物酶活性比色法定量检测试剂盒使用说明书

血液谷胱甘肽过氧化物酶活性比色法定量检测试剂盒产品说明书（中文版）

主要用途

血液谷胱甘肽过氧化物酶（GSH PX）活性比色法定量检测试剂是一种旨在通过谷胱甘肽过氧化物酶和谷胱甘肽还原酶的酶偶联反应系统中还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化后峰值的降低，即采用比色法来测定血液样品中酶活性的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种血液样品（动物、人体等）包括血浆和血清谷胱甘肽过氧化物酶的总活性检测。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定。

技术背景

谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase；GSH PX或GPX；EC 1.11.1.9）属于硒蛋白（Selenoprotein）家属成员之一，在细胞浆和线粒体组分中表达，其功能在于催化各种过氧化物的还原，包括氢过氧化物、过氧化氢等，保护细胞免受氧化损害。酶活的降低与巴金森氏、慢性肾小球肾炎（glomerulonephritis）等疾病有关。在哺乳动物中，存在四种类型的谷胱甘肽过氧化物酶：I型为经典的细胞内型；II型为胃肠道型；III型为血浆型；IV型为磷脂氢过氧化代谢型（phospholipid hydroperoxide metabolizing）。除IV型（为单体）外，谷胱甘肽过氧化物酶的结构为同源四体，每个单体为22至23kd，其活性结构域含有硒代半胱氨酸（selenocysteine）。基于谷胱甘肽过氧化物酶催化有机过氧化物（ROOH）的还原，同时使还原型谷胱甘肽（reduced glutathione；GSH）氧化成氧化型谷胱甘肽（oxidized glutathione； GSSG）；进而在谷胱甘肽还原酶（glutathione reductase；GR）的作用下，氧化型谷胱甘肽被还原成还原型谷胱甘肽，同时还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate；NADPH）转化为氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（oxidized nicotinamide adenine dinucleotide phosphate；NADP），根据其氧化后峰值的降低（340nm 波长），来定量分析谷胱甘肽过氧化物酶的总活性。谷胱甘肽过氧化物酶偶联循环反应系统为：

产品内容

缓冲液（Reagent A）  毫升

底色液（Reagent B）  毫升

反应液（Reagent C）    毫升

阴性液（Reagent D）    毫升

产品说明书     1份

保存方式

保存底色液（Reagent B）和反应液（Reagent C）在－20℃冰箱里；其余的保存在4℃冰箱里；底色液（Reagent B）和反应液（Reagent C）避免光照；有效保证6月

用户自备

1.5毫升离心管：用于样品操作和保存的容器

（微型）台式离心机：用于样品操作

比色皿或酶标板：用于比色的容器

分光光度仪或酶标仪：用于比色分析

实验步骤

• 样品准备

选择一：血浆样品

• 准备好肝素、ACD或EDTA等抗凝管
• 抽取1毫升血液，置于抗凝管里
• 放进4℃微型台式离心机离心10分钟，速度为700g（或3000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取200微升上层黄色液体到新的1.5毫升离心管――此为血浆成分（注意：避免触碰白色液体层）
• （选择步骤）移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒）
• 即刻放进－70℃保存或置于冰槽里继续后续操作

选择二：血清样品

• 准备好不含抗凝剂的储存管 
• 抽取1毫升血液，置于储存管里
• 室温下，静置30分钟，直至血液凝结
• 放进4℃微型台式离心机离心15分钟，速度为2000g（或5000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取200微升上层黄色液体到新的1.5毫升离心管――此为血清成分（注意：避免触碰白色液体层）
• （选择步骤）移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－GMS30030.1）
• 即刻放进－70℃保存或置于冰槽里继续后续操作
• 测定准备
• 开启并设定好分光光度仪（温度为25℃）：波长340nm，间隔60秒，读数6次（共5分钟），并置零 
• 从－20℃冰箱里取出试剂，置于冰槽里融化；底色液（Reagent B）避免光照
• 缓冲液（Reagent A）室温下均衡温度
• 背景对照测定
• 移取xx微升缓冲液（Reagent A）到新的比色皿
• 加入xx微升底色液（Reagent B）
• 加入xx微升反应液（Reagent C）
• 上下倾倒数次，混匀
• 在25℃温度下孵育3分钟
• 加入xx微升阴性液（Reagent D）
• 上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）
• 即刻放进分光光度仪检测，此为背景空对照（0分钟读数－5分钟读数）
• 样品测定
• 移取xx微升缓冲液（Reagent A）到新的比色皿
• 加入xx微升底色液（Reagent B）
• 加入xx微升反应液（Reagent C）
• 上下倾倒数次，混匀
• 在25℃温度下孵育3分钟
• 加入50微升待测样品（100微克蛋白）（注意：样品须清澈）
• 上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）
• 即刻放进分光光度仪检测，此为样品读数（0分钟读数－5分钟读数） 

五、计算样品活性

• 酶标板测定
• 在96孔酶标板上做好相应标记：背景对照和样品
• 分别移取xx微升缓冲液（Reagent A）到96孔板中
• 分别加入xx微升底色液（Reagent B）
• 分别加入xx微升反应液（Reagent C）
• 轻轻摇动96孔酶标板
• 在25℃温度下孵育3分钟
• 分别加入xx微升阴性液（Reagent D）或待测样品（20微克蛋白）到相应孔中（注意：样品须清澈）
• 轻轻摇动酶标板
• 即刻放进酶标仪检测：0分钟读数和5分钟读数
• 活性计算：

注意事项

• 本产品为20次（比色皿）和80次（酶标板）操作，包括背景对照
• 操作时，须戴手套
• 系统操作过程中，背景测定只需1次
• 检测敏感范围为5至30毫单位/毫升
• 待测样本避免含有还原剂（DTT和巯基乙醇）以及某些去垢剂（TWEEN-20、TRITON X-100）等，干扰检测
• 建议使用比色皿测定
• 样品须澄清，至关重要 
• 加样后3秒内比色测定
• 背景空对照0秒读数通常0.2至0.8为理想状态
• 测定值由高到低变化；测定可持续5分钟
• 比色测定后，比色皿须清洗彻底
• 样本测定0分钟读数高于5分钟读数表明具有酶活性
• 建议待测样本蛋白浓度为100微克/50微升；如果样本酶活性过低或过高，则可以增加或降低样本量（本公司提供  Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－GMS30030.1）
• 如果待测样品浓度过高或过低，可以调整样品浓度
• 谷胱甘肽过氧化物酶单位活性定义为：在25℃，pH 7.5条件下，每分钟内能够转化1微摩尔还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸所需的酶量作为一个活性单位
• 本公司提供系列细胞酶学检测试剂产品

质量标准

• 本产品经鉴定性能稳定
• 本产品经鉴定检测敏感