病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒使用说明书

病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒

一、简介

病毒总核酸提取试剂盒适合于从血清、血浆、组织匀浆等样品中提取病毒总核酸。试剂盒基于硅胶柱纯化技术，提取过程中无需使用有毒的酚氯仿抽提，也无需进行耗时的醇类沉淀。该产品已经成功地提取了乙肝A/C、丙肝、以及诺如病毒标准品等的核酸。获得的DNA/RNA可直接用于PCR、RT-PCR、以及LAMP等系列下游实验。

二、组成

注意：

1. Carrier RNA 固体使用前必须用 Nuclease Free Water 溶解至 1µg/µl，涡旋溶解。分装保存-70℃。如需长期保存于-20℃，请先按照使用次数分装后保存。

2. 溶解Proteinase K（20mg/ml）：加入Protease Dissolve Buffer溶解Proteinase K至终浓度为 20mg/ml。Proteinase K干粉在2-8℃保存一年，但溶解的 Proteinase K 须分装保存于-20℃。 反复冻融 Proteinase K 会影响其活性。

3. Buffer VHB 使用前必须用14 ml无水乙醇稀释，并于室温保存。

4. Buffer RW2 使用前必须用80 ml无水乙醇稀释，并于室温保存。

三、保质期

本产品除Proteinase K和Carrier RNA外，其它组份可在室温(15-25℃)保存12个月，长期保存时需置于2-8℃。Proteinase K 和 Carrier RNA 干粉室温运输，收到试产品后请保存于-20℃，溶解后分装保存于-20℃。

四、需要准备的材料和工具

• Buffer PBS
• 无水乙醇
• 洁净的镊子和剪刀
• 微量移液器（100-1000μl，10-100μl）
• 无RNA酶的离心管和吸头
• 涡旋振荡器
• 离心机（转速≥10,000 rpm）

五、实验步骤

• 转移20 µl Proteinase K 至1.5 ml离心管中。
• 转移200 µl样品，如血清、血浆、尿液、 培养液上清、或其它无细胞体液至装有 Proteinase K 的离心管中，振荡混匀5秒。若样品不足200 µl，用Buffer PBS或Nuclease Free Water 补足。

（固体组织样品先用 Buffer PBS浸泡或匀浆后，离心取上清进行操作；干粉样品请先用Buffer PBS充分溶解后离心取上清进行操作。）

• 转移200 µl Buffer AL/Carrier RNA至样品中，涡旋混匀15秒。

使用前，按每1 ml Buffer AL加入15 µl Carrier RNA（1 µg/µl）。该混合液室温可保存2天。

• 56ºC水浴10分钟。
• 加入250µl 无水乙醇至裂解液中，涡旋混匀 15 秒。室温静置 3 分钟。
• 把核酸吸附柱装在2ml 收集管中。转移混合液至柱子中。8,000 g离心 30-60秒。
• 倒弃滤液把柱子装回收集管中。加入500 µl Buffer VHB（已用无水乙醇稀释）至柱子中。8,000 g离心30-60秒。

使用前 Buffer VHB 必须按瓶子标签所示用无水乙醇稀释。

• 倒弃滤液把柱子装回收集管中。加入500 µl Buffer RW2（已用无水乙醇稀释）至柱子中。8,000 g 离心30-60秒。

使用前 Buffer RW2 必须按瓶子标签所示用无水乙醇稀释。

• 倒弃滤液把柱子装回收集管。加入500 µl Buffer RW2（已用无水乙醇稀释）至柱子中。8,000 g离心30-60秒。
• 倒弃滤液把柱子套回收集管。10,000 rpm 离心空柱3分钟甩干柱子。
• 将柱子转移至新的1.5ml离心管。加入15~30 µl Nuclease Free Water至柱子的膜中央。13,000 g离心1分钟。
• 弃去柱子，把DNA/RNA 保存于-80ºC。

六、常见问题解答

1. 柱子堵塞

• 样品用量太多：处理动物抗凝血液时，样品量控制在100~150 µl。尽量使用无细胞的样品，如血浆、血清、组织匀浆液的上清等。
• Proteinase K活性下降：重新制备Proteinase K。使用后Proteinase K必须保存于-20℃。Proteinase K与 Buffer AL不能预先混合。
• 样品含固体颗粒：在第5步加入乙醇前，10,000 g离心3分钟去除未消化的杂质，转移上清液至新的离心管后再加入乙醇。
• 样品裂解不充分：样品与Buffer AL混匀不充分。重新提取，加入Buffer AL后先颠倒混匀3~5次，然后以最高速度涡旋让样品与Buffer AL充分混匀。

2. 下游应用结果不理想

• 样品被反复解冻：避免反复冻融样品。推荐使用新鲜样品或只解冻过一次的样品。
• Nuclease Free Water 被污染：更换新的 Nuclease Free Water或DEPC处理水。
• 试剂准备有误：按瓶子标签所示，加入合适体积的无水乙醇至 Buffer VHB 和Buffer RW2 中。
• Proteinase K活性下降：重新制备Proteinase K。使用后Proteinase K 必须立即保存于-20℃。分装保存 Proteinase K，避免反复冻融。
• 乙醇残留：柱子在洗脱前，需要空甩去除乙醇。对于敏感的应用，柱子在洗脱后，打开柱子的盖子，放置 10~15 分钟让乙醇彻底挥发。
• 洗脱效率：处理富含 DNA 的样品时，把 Nuclease Free Water预热至55℃后再进行洗脱，有利于提高DNA得率。
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