胡桃源性成分核酸检测试剂盒（一管式PCR-荧光探针法）使用说明书

胡桃源性成分核酸检测试剂盒（一管式PCR-荧光探针法）

◆ 产品说明

物种鉴定系列中的过敏原鉴定试剂，可针对食品中过敏原成分的特异核酸片段进行扩增，通过实时扩增曲线判定结果。本产品用于食品原料或加工食品中过敏原胡桃成分的检测，检出限为0.01%。

◆ 产品组成（96测试）

022102LⅡ
试剂	含量
A-胡桃源-P	20μL × 8管× 12排
NG-P	100μL × 3支
PG-胡桃源-P	100μL × 2支

• 适用仪器

    ABI 7500、CFX 96、Mx 3005P、LineGene9600等实时荧光PCR仪。

◆ 自备耗材和仪器

 ①冰盒；②移液器（0.5-10μL，10-100μL，100-1000μL）及配套灭菌吸头；③离心机；④涡旋混匀器；⑤金属浴。

◆ 注意事项

1．本试剂检测灵敏度高。为了防止污染，实验要分区操作。

   1）第一区：样本制备区。

 2）第二区：模板添加区。

   3）第三区：扩增及产物分析区。

   ★ 分区之间最好进行物理性隔离，避免人为因素造成的污染。

2．实验过程中穿戴工作服和乳胶手套，不同区域独立使用工具，需更换手套和实验服。

3．严格按照操作步骤操作，试剂配制和加样等步骤请严格按照说明书要求在冰盒上操作。

4．反应液中的成分对光敏感，应避光保存。试剂使用前要完全解冻，但应避免反复冻融，推荐使用前离心30秒，并按检测频次将反应液以适当体积分管保存。

5．反应结束后，扩增管请置于密封袋内丢弃，当日清理，开盖易造成气溶胶污染，禁止开盖。

6．不同批号试剂请勿混合使用，在有效期内使用。

◆样品处理

参照《SN/T 1961.6-2013 出口食品过敏原成分检测 第6部分：实时荧光PCR方法检测胡桃成分》或其他标准处理样品，制备的样本保存待用。

样品的采集和制备是过敏原成分鉴别的重要步骤，防止交叉污染的措施按照GB/T 27403中的规定执行。

详细步骤请按照标准操作或查阅食安通软件。

◆ 实验操作

1.模板制备（样本制备区）

  建议使用配套动物基因组DNA提取试剂盒，具体过程详见产品说明书。

2.添加模板（模板添加区，放置于冰盒上进行）

  剪下所需测试数的已含有反应液的PCR管，放置在室温待解冻后，离心30秒后揭开封口膜，向每管反应液中分别加入5μL模板，顺序为NG、待测样品模板、PG-胡桃源-P。盖好配套的PCR管盖后，涡旋混匀30s，离心1min，立即进行PCR扩增反应。

3.扩增反应（扩增及产物分析区）

   使用荧光定量PCR仪，荧光基团选择FAM，淬灭基团选择TAMRA。

   按下列条件设置扩增反应：

PCR循环			荧光收集位点
50℃	2分钟	1个循环	—
95℃	15分钟	1个循环	—
95℃	15秒	40个循环	—
60℃	1分钟		※

 

4.基线和阈值设定

  基线调整取3-15个循环的荧光信号，阈值线应超过阴性对照扩增曲线的最高点。

◆ 结果判定

检测样品Ct值≤35，则判定为被检样品阳性，检出过敏原胡桃成分。

检测样品Ct值≥40，则判定为被检样品阴性，未检出过敏原胡桃成分。

检测样品35＜Ct值＜40，则重复一次。如再次扩增后Ct值仍为＜40.0，则判定为被检样品阳性，检出过敏原胡桃成分。如再次扩增后Ct值≥40，则判定为被检样品阴性，未检出过敏原胡桃成分。

• NG反应为平滑直线，PG反应为“S”型扩增曲线，此次检测结果有效，否则无效。如重复检测结果仍为无效，请与技术支持人员联系。
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