动物组织基因组DNA提取试剂盒使用说明书

动物组织基因组DNA提取试剂盒

一、简介

    动物组织基因组DNA提取试剂盒(DePure Tissue DNA Kit)适用于动物组织、培养细胞、抗凝血液、体液、分泌液等生物样品的DNA提取。试剂盒基于硅胶柱纯化技术，提取过程中无需使用有毒的酚氯仿抽提，也无需进行耗时的醇类沉淀，整个提取过程只需30分钟（不含消化时间）。动物组织基因组DNA提取试剂盒一次可处理1~20mg组织样品、1~200µl抗凝血液或体液样品、5×10⁶个培养细胞，得到的DNA可直接用于PCR、Southern blot、LAMP、Real-Time PCR等下游实验。

二、原理

动物组织基因组DNA提取试剂盒基于硅胶柱纯化方式。样品在裂解液(Buffer MTL)和蛋白酶作用下裂解消化，DNA释放到裂解液中。加入Buffer AL和乙醇后，转移至柱子中过滤，DNA被吸附上柱子的膜上，而蛋白质则不被吸附而随溶液滤出去除。柱子经Buffer GW1洗涤蛋白质和其它杂质，经Buffer GW2洗涤去除盐分，最后DNA被低盐缓冲液(Buffer AE)洗脱，洗脱的DNA可直接用于PCR、Southern blot、LAMP、Real-Time PCR等下游实验。

DePure硅胶柱是采用高结合力的玻璃纤维滤膜为基质。滤膜在高浓度离子化剂(如盐酸胍或异硫氰酸胍)条件下，可通过氢键和静电等物理作用吸附核酸，而蛋白质或其它杂质不被吸附而去除。吸附了核酸的滤膜经洗涤去除蛋白质和盐，最后可以用低盐缓冲液(Buffer AE)洗脱出滤膜上吸附的核酸。得到的核酸纯度高，可直接用于各种下游实验。

三、组成

DePure Tissue DNA Kit

四、保质期

动物组织基因组DNA提取试剂盒除Proteinase K外，可在室温下(15-25℃)干燥保存12个月。长期保存时需置于2-8℃。低温下，Buffer MTL可能会有沉淀形成，需37℃水浴让沉淀完全溶解。Proteinase K干粉和RNase Solution室温运输，收到试剂盒后请保存于2~8℃或-20℃。

五、需要准备材料和工具

• 无水乙醇(96%-100%)
• 灭菌的离心管和吸头
• 小型离心机(13,000rpm)
• 水浴锅或金属浴
• 按瓶子标签所示，加入适量的Protease Dissolve Buffer至Proteinase K干粉中至终浓度为20mg/ml，颠倒混匀让蛋白酶K充分溶解，于-20℃保存。

• Buffer GW1使用前，须按瓶子标签所示，加入无水乙醇进行稀释。

• Buffer GW2使用前，须按瓶子标签所示，加入无水乙醇进行稀释。

六、方案1. 动物组织DNA提取

    该方案适合于从1~20mg动物组织，如肝脏、脾脏、肾脏、老鼠尾巴等组织样品中提取DNA，以下离心操作都在室温进行。

• 把1~20 mg组织样品(或10 mg肝脏、肺或脾脏)剪切成尽量小的碎片，并转移至1.5ml离心管中。加入230µl Buffer MTL和20µl Proteinase K，涡旋混匀。55℃水浴1~3小时或过夜消化样品。水浴期间需偶尔涡旋混匀，或放置于振荡水浴涡中。

注：适当的组织用量才能获得理想的提取结果，样品过多会降低产量和纯度。脾脏、肝脏、肾脏等组织样品富含DNA，不宜超过10mg。肌肉和皮肤等样品用量可用到30mg以提高产量。将组织块尽量剪切成小碎片可缩短消化时间。采用液氮研磨，匀浆器处理组织样品可达到缩短消化时间的目的。小鼠尾巴最大用量为1.2cm，大鼠尾巴最大用量为0.6cm。消化时间取决于样品的类型和匀浆效果。一般组织样品需1-3小时，老鼠尾巴需6-8小时。过夜消化没有负面影响。

• 加入5µl RNase Solution至消化液中混匀。室温或37℃水浴锅中放置15~60分钟降解RNA。

注：RNase Solution消化时间取决于样品类型。肝脏和肾脏富含RNA，需较长的消化时间。

• (可选)10,000rpm离心3分钟。转移上清液至新的1.5ml离心管中。

注：若消化液比较浑浊或存在明显的颗粒，不要省略此步。

• 加入250µl Buffer AL至消化液中。最高速度涡旋混匀30秒。70℃水浴10分钟。
• 加入250µl无水乙醇至消化液中。最高速度涡旋混匀30秒。

注：处理肝脏或脾脏等组织时，加入乙醇时会有沉淀形成，属正常现象。用移液枪吸打10-15次尽量打散沉淀团。

• 把DePure gDNA Mini Column装在2ml收集管中。转移第五步获得的混合液(包括沉淀)至柱子中。10,000rpm离心1分钟。

注：若柱子出现堵塞，延长离心时间。

• 倒弃流出液，把柱子重新装回收集管中。加入500µl Buffer GW1(已用乙醇稀释)至柱子上。10,000rpm离心1分钟。

注：Buffer GW1须用无水乙醇稀释。按瓶子标签或说明书指示进行稀释。

• 倒弃滤液，把柱子重新装回收集管中。加入500 µl Buffer GW2(已用乙醇稀释)至柱子中。10,000rpm离心1分钟。

注：Buffer GW2须用无水乙醇稀释。按瓶子标签或说明书指示进行稀释。

• 倒弃滤液，把柱子重新装回收集管中。再加入500 µl Buffer GW2(已用乙醇稀释)至柱子中。10,000rpm离心1分钟。
• 倒弃流出液，把柱子重新装回收集管中。10,000 × g离心2分钟去除柱子中残留的乙醇。
• 将柱子装在新的1.5ml离心管中。加入30~100µl预热至70℃ Buffer AE至柱子的膜中央。放置3分钟。10,000 rpm离心1分钟。
• (可选)再加入30~100µl预热至70℃ Buffer AE至柱子的膜中央。放置3分钟。10,000 × g离心1分钟。

注: 处理DNA含量很低的样品无需第二次洗脱。

• 丢弃DNA结合柱，DNA保存于2-8℃，长期保存需保存于-20℃。

七、方案2. 体液/细胞DNA提取

    该方案适合于从动物血液，血清，血浆，唾液等液体样品中直接提取DNA，以下离心操作都在室温进行。

• 样品的处理
  • 红细胞带核的血液样品：鸟类/鱼类等非哺乳类动物血液的红细胞带细胞核，其DNA含量极为丰富。在1.5ml离心管中，加入1-10µl抗凝血液样品。用Buffer PBS或灭菌水调整总体积为200 µl，涡旋混匀，按第2步进行。
  • 红细胞不带核的血液样品：在1.5ml离心管中，1-200µl抗凝血液样品。用Buffer PBS或灭菌水调整总体积为200 µl，按第2步进行。
  • 唾液或其它液体样品：在1.5ml离心管中，加入1-200µl唾液或其它液体样品，用Buffer PBS或灭菌水调整总体积为200 µl，按第2步进行。
  • 培养细胞(5 x 10⁶)：500 rpm离心收集细胞，倒弃培养液。加入200µl Buffer PBS或灭菌水涡旋重悬细胞。
• 加入20µl Proteinase K至样品中，轻轻拍打几次混匀。
• 加入200µl Buffer AL至样品中，最高速度涡旋混匀30秒。65℃水浴30分钟。

注：若需去除RNA，加入5ul RNase A至消化液中，室温静置15~30分钟。

• 加入200µl无水乙醇至消化液中。最高速度涡旋混匀30秒。

注：若加入乙醇后有沉淀形成，用移液枪吸打5次打散沉淀团。

• 按方案1的第6~13步进行操作。

八、常见问题解答

该列表可能有利于您解决在提取过程中所碰到的问题。若您对试剂盒存在疑问或有良好的建议，又或者您在分子生物学实验中碰到问题，都请您联系我们。我们将竭尽所能为您排扰解难。

若以上的解答还是无法解决您的问题，请您联系我们。