细菌基因组DNA提取试剂使用说明书

细菌基因组DNA提取试剂使用说明书

◆ 产品说明

基于硅胶柱纯化方式。试剂中的溶菌酶消化去除细菌的细胞壁，革兰氏阳性细菌还可加入玻璃珠涡旋破壁，在裂解液和蛋白酶作用下裂解消化，DNA释放到裂解液中。加入乙醇后，转移至吸附柱中过滤，DNA被吸附至吸附柱的膜上，而蛋白质则被去除。吸附柱经Buffer GW2洗涤后去除其他杂质，最后通过低盐缓冲液(Buffer AE等)洗脱DNA，洗脱的DNA可直接用于恒温荧光法和荧光定量PCR检测等。

◆ 产品组成

• 储存条件及有效期

Proteinase K干粉和Lysozyme为干粉状，常温运输，保存于2 - 8℃或-20℃，其他组分可在室温下保存，保质期为一年。低温状态下，Buffer SDS或有微量沉淀形成，需37℃下使其溶解。

• 自备材料

• 无水乙醇（≥96%）；
• 离心管和吸头；
• 离心机；
• 水浴锅或金属浴

◆ 试剂配制

1）添加0.6ml Protease Dissolve Buffer至Proteinase K干粉中，颠倒混匀使蛋白酶K充分溶解，于-20℃保存。

2）添加2ml Protease Dissolve Buffer至Lysozyme管子中，颠倒混匀使溶菌酶充分溶解，于-20℃保存。

3）添加40 ml无水乙醇稀释Buffer GW2，于室温下保存。

◆ 使用方法

一. 革兰氏阴性细菌DNA提取

 该方案适合于从﹤1.5 × 10⁹个革兰氏阴性细菌中提取总DNA。细菌数量可以通过分光光度计进行测量。1OD₆₀₀约为1.5 × 10⁹个革兰氏阴性细菌。

• 转移0.5-1ml细菌培养液(<1.5 × 10⁹个细菌)至1.5ml离心管中。10,000rpm离心1分钟收集细菌，倒弃培养液。
• 加入200µl Buffer STE、10µl Lysozyme和10µl Proteinase K至细菌沉淀团中。涡旋充分重悬细菌，37℃水浴10~30分钟。
• 加入220µl Buffer DL至细菌重悬液中。涡旋混匀，65℃水浴消化30分钟。
• 加入220µl无水乙醇至裂解液中。最高速度涡旋30秒。

注：这一步若有絮状沉淀出现，用移液枪吸打几次尽量打散沉淀。

• 把吸附柱Column装在2ml收集管中。把第4步获得的混合液(包括沉淀)转移至吸附柱中。10,000rpm离心1分钟。

注：若吸附柱出现堵塞，提高离心速度至13,000 rpm，离心3分钟。

• 倒弃滤液，把吸附柱装回收集管中。加入600µl Buffer GW2(已用乙醇稀释)至吸附柱中。10,000rpm离心1分钟。

注：Buffer GW2须用无水乙醇稀释，按瓶子标签或说明书指示进行稀释。

• 倒弃滤液，把吸附柱装回收集管中。再加入300µl Buffer GW2(已用乙醇稀释)至吸附柱中。10,000rpm离心3分钟。
• 将吸附柱装在新的1.5ml离心管中。加入30-50µl预热至65℃ Buffer AE至吸附柱膜中央。放置3分钟。10,000rpm离心1分钟。

9.  丢弃DNA结合柱，DNA保存于2-8℃，长期保存需保存于-20℃。

二. 革兰氏阳性细菌DNA提取

 该方案适合于从﹤1.5 × 10⁹革兰氏阳性细菌中提取总DNA。细菌数量可以通过分光光度计进行测量。1OD₆₀₀约为1.5 × 10⁹个革兰氏阳性细菌。革兰氏阳性细胞的细胞壁很厚，不能直接进行裂解。需通过溶菌酶消化去除细胞壁。革兰氏阴性细菌和大部分的革兰氏阳性细菌如杆菌，通过酶法处理就可达到良好的破壁效果。某些革兰氏阳性细菌因带有很厚的细菌壁，还需结合珠磨法才能达到效果。

• 酶法：采用溶菌酶(Lysozyme)消化细胞壁，把细菌转化为原生质体。葡萄珠菌属包有较厚的细胞壁，还需结合溶葡萄球菌素(Lysostaphin)一起消化。
• 珠磨联酶法：先采用溶菌酶消化细胞壁，然后采用酸洗玻璃珠(0.1-0.2mm)高速涡旋振荡使细菌发生裂解。处理葡萄球菌，粪脓球菌等裂解细菌时，加入玻璃珠涡旋能明显提高产量。

• 转移0.5-1ml细菌培养液(﹤1.5 × 10⁹个细菌)至1.5ml离心管中。10,000rpm离心1分钟收集细菌，倒弃培养液。

注：若培养液密度比较大，离心速度和离心时间都可能需要提高，以保证细菌的充分沉淀收集。若需要从菌斑中提取DNA：用接种环刮下菌斑，按第2步进行操作，把菌斑转移至Buffer STE，涡旋混匀。

• 加入200µl Buffer STE和30µl Lysozyme至细菌沉淀团中。涡旋充分重悬细菌，37℃水浴30分钟。处理葡萄球菌属的细菌时，最好再加入1µl Lysostaphin(20mg/ml)。
• 加入15µl Buffer SDS和10µl Proteinase K至细菌重悬液中。涡旋混匀，65℃水浴消化30分钟。
• 室温下，10,000rpm离心3分钟。转移上清液至新的离心管中。
• 加入250µl Buffer DL和250µl无水乙醇至裂解液中。最高速度涡旋30秒。

注：这一步若有明显的絮状沉淀，用移液枪吸打几次尽量打散沉淀。

• 把吸附柱Column装在2ml收集管中。转移第5步获得的混合液(包括沉淀)至吸附柱中。10,000rpm离心1分钟。

注：若吸附柱出现堵塞，提高离心速度至13,000 rpm，离心3分钟。

• 倒弃滤液，把吸附柱装回收集管中。加入600 µl Buffer GW2(已用乙醇稀释)至吸附柱中。10,000rpm离心1分钟。

注：Buffer GW2须用无水乙醇稀释，按瓶子标签或说明书指示进行稀释。

• 倒弃滤液，把吸附柱装回收集管中。再加入300µl Buffer GW2(已用乙醇稀释)至吸附柱中。10,000rpm离心2分钟。
• 将吸附柱装在新的1.5ml离心管中。加入30-50µl预热至65ºC Buffer AE至吸附柱膜中央。放置3分钟。10,000rpm离心1分钟。
• 丢弃DNA结合柱，DNA保存于2-8℃，长期保存需保存于-20℃。

三.组织或液体样品中细菌DNA提取

该方案适合于从各种组织、血液、分泌液等液体样品中提取基因组DNA和寄生的细菌DNA。纯化的DNA可直接用于各种细菌的检测。若需从粪便样品中提取细菌DNA，我们推荐使用DePure Stool DNA Kit，若需要从土壤样品中提取细菌DNA，推荐使用DePure Soil DNA Kit。

• 按以下方案进行预处理：

• 固体样品：将10mg固体样品剪切成小碎片，并转移至1.5ml离心管中，加入200µl Buffer STE和10µl Buffer SDS。
• 全血样品：取<1ml抗凝血液按常规流程分离得到细胞和细菌。加入200µl Buffer STE和10µl Buffer SDS，用移液枪吸打重悬细胞。
• 分泌物或血清等: 10,000 × g离心3分钟收集细胞和细菌；倒弃上清液，加入200µl Buffer STE和10µl Buffer SDS，用移液枪吸打重悬细胞。
• 粘稠的分泌液：取100µl或100mg 痰液等，加入100µl Buffer STE，10µl Buffer SDS和5 µl 1M 二硫苏糖醇DTT。（若需要从痰液中分离结核杆菌或真菌，可先用NaOH进行痰液液化，离心收集得到沉淀后再进行操作。）

• 加入10µl Proteinase K至重悬液中。涡旋混匀。55℃水浴1-3小时或直至样品完全消化。按细菌和细胞总DNA的提取流程，或难裂解细菌提取流程进行操作。

细菌和细胞总DNA提取 

• (可选) 95℃水浴10分钟进一步裂解细菌。
• 10,000rpm离心3分钟。转移上清液至新的1.5ml离心管中。
• 加入200µl Buffer DL和200µl无水乙醇至上清液中。涡旋20秒。
• 按第7-12步进行操作。

难裂解细菌DNA提取

• 10,000rpm离心3分钟收集未消化的细菌。吸弃所有的上清液。
• 加入200µl Buffer STE和30µl Lysozyme至细菌沉淀团中。涡旋充分重悬细菌，37℃水浴30-60分钟。处理葡萄球菌属的细菌时，最好再加入1µl Lysostaphin(20mg/ml)。
• 加入20µl Buffer SDS至细菌重悬液中。涡旋混匀，95℃水浴10分钟。
• 加入250µl Buffer DL和250µl无水乙醇至裂解液中。最高速度涡旋30秒。按第7-12步进行操作。

过柱吸附DNA

• 把吸附柱Column装在2ml收集管中。转移上一步获得的混合液(包括沉淀)至吸附柱中。10,000rpm离心1分钟。

注：若吸附柱出现堵塞，提高离心速度至13,000rpm，离心3分钟。

• 倒弃滤液，把吸附柱重新装回收集管中。加入650 µl Buffer GW2(已用乙醇稀释)至吸附柱中。10,000rpm离心1分钟。

注：Buffer GW2须用无水乙醇稀释。按瓶子标签或说明书指示进行稀释。

• 倒弃滤液，把吸附柱重新装回收集管中。再加入300 µl Buffer GW2(已用乙醇稀释)至吸附柱中。10,000rpm离心2分钟。
• 将吸附柱装在新的1.5ml离心管中。加入30-100µl预热至65℃ Buffer AE至吸附柱膜中央。放置3分钟。10,000rpm离心1分钟。
• 再加入30-100µl预热至65℃ Buffer AE至吸附柱的膜中央。放置3分钟。10,000rpm离心1分钟。

12.  丢弃DNA结合柱，DNA保存于2-8℃，长期保存需保存于-20℃。

四.拭子样品中细菌总DNA提取

该方案适合于从各种拭子样品中提取基因组DNA和总细菌DNA。

• 转移拭子样品至2ml离心管中。加入350µl Buffer STE和30µl Lysozyme至拭子样品中。涡旋充分重悬细菌，37℃水浴10-30分钟。处理葡萄球菌属的细菌时，最好再加入1µl Lysostaphin(20mg/ml)。
• 加入30µl Buffer SDS和10µl Proteinase K至细菌重悬液中。涡旋混匀，65℃水浴消化30分钟。
• (可选)95℃水浴10分钟进一步裂解难裂解的细菌。
• 加入400µl Buffer DL和400µl无水乙醇至裂解液中。涡旋20秒。
• 把DNA柱装在收集管中。转移600µl混合液(第4步获得的混合液)至吸附柱中。10,000rpm离心1分钟。
• 倒弃流出液，把吸附柱装回收集管中。把剩余的混合液转移至吸附柱中。10,000rpm离心1分钟。
• 倒弃滤液，把吸附柱重新装回收集管中。加入650 µl Buffer GW2(已用乙醇稀释)至吸附柱中。10,000rpm离心1分钟。

注：Buffer GW2须用无水乙醇稀释。按瓶子标签或说明书指示进行稀释。

• 倒弃滤液，把吸附柱重新装回收集管中。再加入300 µl Buffer GW2(已用乙醇稀释)至吸附柱中。10,000rpm离心2分钟。

9.   将吸附柱装在新的1.5ml离心管中。加入30-50µl预热至65℃ Buffer AE至吸附柱膜中央。放置3分钟。10,000rpm离心1分钟。丢弃DNA结合柱，DNA保存于2-8℃，长期保存需保存于-20℃。

【注意事项】

1．实验过程中穿戴工作服、乳胶手套和口罩，使用移液器，试验产生的所有废弃物及时处理。

2．请严格按照操作步骤操作，如有技术问题，请及时与我们联系。

3．请在有效期内使用试剂盒。