霍乱弧菌核酸检测试剂盒（一管式PCR-荧光探针法）使用说明书

霍乱弧菌核酸检测试剂盒（一管式PCR-荧光探针法）

◆ 产品说明

致病菌检测系列可针对食品、饲料等样品中的致病微生物的特异核酸片段进行扩增，仪器实时监测扩增过程中的荧光信号变化，自动判读结果。本产品用于霍乱弧菌的检测。检出限为10³ CFU/ml。

◆ 产品组成（96测试）

◆ 适用仪器

   ABI 7500、CFX 96、Mx 3005P、LineGene9600等实时荧光PCR仪。

◆ 自备耗材和仪器

①冰盒；②移液器（0.5-10μL，10-100μL，100-1000μL）及配套灭菌吸头；③离心机；④涡旋混匀器；⑤金属浴；⑥均质机、搅拌机或研钵等研磨器具；⑦电子天平。

◆ 注意事项

1．本试剂检测灵敏度高。为了防止污染，实验要分区操作。

   1）第一区：样本制备区。

 2）第二区：模板添加区。

   3）第三区：扩增及产物分析区。

   ★ 分区之间最好进行物理性隔离，避免人为因素造成的污染。

2．实验过程中穿戴工作服和乳胶手套，不同区域独立使用工具，需更换手套和实验服。

3．严格按照操作步骤操作，试剂配制和加样等步骤请严格按照说明书要求在冰盒上操作。

4．反应液中的成分对光敏感，应避光保存。试剂使用前要完全解冻，但应避免反复冻融，推荐使用前离心30秒，并按检测频次将反应液以适当体积分管保存。

5．反应结束后，扩增管请置于密封袋内丢弃，当日清理，开盖易造成气溶胶污染，禁止开盖。

6．不同批号试剂请勿混合使用，在有效期内使用。

◆ 样品处理

参照《SN/T 1022-2010 进出口食品中霍乱弧菌检验方法》中的7.1和7.2处理样品，对样品进行前增菌，制备的菌液保存待用。

以无菌操作取检样25 g，放入装有225 mL灭菌APW增菌液的均质杯内，于8000rpm/min～10000rpm/min均质1 min～2 min，或以剪刀充分剪碎，制成1:10样本匀液。深冻样品、干品、盐渍产品的初始增菌液放置在37℃ ± 1℃培养6 h ± 1 h，新鲜样品的初始增菌液放置在41.5 ℃ ± 1 ℃培养6 h ± 1 h。如果样品不够25g，则取全部样品，加入9xmL增菌液以获得10-1浓度的样品匀液。若上述制备的待检样品不能在当日进行培养，应放置在2℃~8℃保存至次日。为提高检出率，可进行第二次增菌，取1 ml培养物接种到10 ml的APW中，置于41.5 ℃ ± 1 ℃培养18 h ± 1 h（加入样品前，APW应预先保温至37℃±1℃）。

详细步骤请按照标准操作或查阅食安通软件。

◆ 实验操作

1. 模板制备（样本制备区）

建议使用试剂配套细菌组DNA提取系列产品，具体过程详见产品说明书。

2．添加模板（样本制备区，放置于冰盒中进行）

剪下所需测试数的已含有反应液的PCR管，放置在室温待解冻后，离心30秒后揭开封口膜，向每管反应液中分别加入5μL模板，顺序为NG、待测样品模板、PG-VC-P。盖好配套的PCR管盖后，涡旋混匀30s，离心1min，立即进行PCR扩增反应。

3. 扩增反应（扩增及产物分析区）

使用荧光定量PCR仪，荧光基团选择FAM，淬灭基团选择TAMRA。

按下列条件设置扩增反应：

4.基线和阈值设定

  基线调整取3-15个循环的荧光信号，阈值线应超过阴性对照扩增曲线的最高点。

◆ 结果判定

检测样品无Ct值或≥40.0，曲线为直线或轻微斜线，无“S”型扩增曲线，可报告样品阴性，不含有霍乱弧菌或含量低于检测限；

检测样品Ct≤35.0，曲线呈“S”型扩增曲线，可直接报告样品阳性，含有霍乱弧菌；

检测样品35.0＜Ct＜40.0，需进行一次重复实验，若Ct值≥40.0则为阴性，否则为阳性。

• NG反应为平滑直线，PG反应为“S”型扩增曲线且Ct值＜30，此次检测结果有效，否则无效。如重复检测结果仍为无效，请与技术支持人员联系。
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