电击和热击感受态细胞的制备

电击和热击感受态细胞的制备

实验试剂

LB培养基，KB培养基，10%甘油，液氮，0.1M CaC1₂溶液

实验设备

超净工作台，摇床，离心机，250mL离心瓶，0. 5mL的离心管

实验材料

大肠杆菌，农杆菌和假单胞杆菌

实验步骤

1. 电击感受态细胞的制备

    1) -80℃ 保存的大肠杆菌，农杆菌或者假单胞杆菌在固体平板上(DH5a，BL21在LB平板上，GV3101在LB/Gen; P.s. pv. tomato 0288-9和P. syringae pv. tabaci 6505在KB平板上)划线。

    2) 接种单克隆于5-10mL液体培养基，37℃ (大肠杆菌)或者28℃ (农杆菌和假单胞杆菌)培养过夜。

    3) 按照1:100-1:500转接到500-1000mL液体培养基，37℃ 培养3-4小时(大肠杆菌)或28℃ 培养8-10小时(农杆菌和假单胞杆菌转化)至细菌达到对数生长期。

    4) 将菌液装入250mL离心瓶中，冰上放置30分钟后，4℃ 离心15分钟。

    5) 弃上清，加入200mL 10%甘油，于冰上缓慢将菌摇散，4℃ 离心15分钟。

    6) 重复前一步骤2-3次，最后弃上清，加入少量10%甘油重悬细菌。

    7) 分装于0. 5mL的离心管中，每管40ul，液氮速冻，-80℃ 存放。

2. 热激感受态的制备

    1) 挑取E.coli BL21单克隆接种到5mL LB培养液中，37℃ 振荡培养过夜。

    2) 按照1:100-1:500转接到500-1000mL液体培养基，37℃ 培养3-4小时至细菌达到对数生长期。

    3) 将菌液装入250mL离心瓶中，冰上放置30分钟后，4℃ 离心15分钟。

    4) 弃上清，加20mL预冷的0.1M CaC1₂溶液轻轻悬浮菌体，冰上放置15-30分钟后于4℃ 离心5分钟。

    5) 弃上清，加2mL冰预冷的0.1M CaC1₂溶液，重悬菌体。

    6) 分装于0. 5mL的离心管中，每管40ul，液氮速冻，-80℃ 存放。