Azure Biosystems Western blotting之实验秘籍

蛋白分离、杂交、检测、分析

前瞻回顾

鉴于小编在《Azure Biosystems Western Blotting工作流程之实验方法的选择》中和大家聊了Western blot的实验方法选择，相信大家已经将您的western blot 实验方法选择好了，那么这期小编和大家聊聊western blot的实验流程中的那些事。

蛋白分离

电泳准备？

玻璃配胶板要清洗干净，以免引起配胶问题，影响蛋白分离

配胶液要充分混匀，凝聚时间要够，如胶凝聚不均匀，会造成胶分辨率差。出现笑脸皱眉条带

电泳时，上样体积和浓度最好保持一致，这样可以防止出现条带过宽或者过窄的情况产生

如何选择膜？

膜上有蛋白质的结合位点，可结合从凝胶中转移的蛋白质。常用的膜是硝酸纤维素膜（NC膜）和PVDF膜。

NC膜

低分子量蛋白检测

通常用于化学发光法

蛋白剥离效果不理想

PVDF膜

低表达蛋白结合能力强

通常用于荧光方法（自发荧光背景低）

剥离和二次杂交时，蛋白的截留能力强

如何建立转膜系统

常用的转膜系统形式为 “三明治” 结构，凝胶和膜紧密贴合，放在两张转印滤纸之间，用电极板夹夹住，置于转印buffer中，正负电极通电后，将蛋白质从凝胶转移到膜上。转印滤纸 （滤纸） 能够保持均匀一致的压力，确保膜和凝胶间没有空隙，并保持转移buffer充盈在“三明治”结构中蛋白完全从凝胶转移至膜上。 

Blot前准备什么？

当优化转印设置、条件及实验时，最重要的是确定样品中所有蛋白是否从胶上完全转移到膜上。使用SelfStain^TM免染胶来显示膜上的所有蛋白 ，并立即进行western blot后续步骤。 

膜封闭

封闭目的是防止非特异性结合，降低背景对目的信号的干扰。如使用脱脂奶粉做封闭液，最好将脱脂奶粉进行滤膜过滤，这样可以减少后期颗粒背景的产生。

一抗孵育

确保新的一抗浓度经过优化。如有确证过的一抗，可尝试将一抗标记荧光染料，直接进行一步法Western blot检测。

洗膜和二抗孵育

每次孵育后，洗去多余的抗体对于降低背景信号至关重要。荧光方法Western blot中，洗膜还可以去除有自发荧光的去垢剂。洗膜的时候如果多张，建议分开进行清洗，同时洗膜液体积不能太少。

化学发光检测

尝试不同的底物增加灵敏度和信号持久性；化学发光底物使用前需要平衡至室温，可以增加酶的活性；数字成像系统要灵敏度很高。

荧光检测

保持所有物品的清洁，确保无背景干扰；印迹膜避光保存；使用背景淬灭板降低背景荧光，增强信噪比。

检测

Azure Biosystems c系列成像系统

Azure c 系列成像系统提供 4 款性能卓越的 Western blot 成像系统。可以选择满足现有实验需求的型号，当需要提升应用范围时，通过升级即可完成

分析

AzureSpot分析软件

AzureSpot 分析软件作为分析胶和膜的工具，把复杂的分析变得简单化。

1.在样品上进行泳道划分           2.设置阈值，检测条带

3.扣除背景，提供有多种背景扣除方法可选4.查看结果，可作出修改或对任意条带边界进行编辑

5.使用标准分子量marker来确定样品的分子量，或者使用标准品来确定浓度