细胞P38α激酶活性光度法定量检测试剂盒使用说明
细胞P38α激酶活性光度法定量检测试剂盒产品说明书（中文版）
主要用途
YIJI细胞P38α激酶活性光度法定量检测试剂是一种旨在通过多肽底物，在P38α激酶敏感性抑制剂存在与否的情况下，受到P38α磷酸化后，进而由丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶连续循环法反应系统，测定产生ADP过程中，伴随的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）的氧化反应， 即采用光度法测定其氧化后吸光峰值的变化，以分析细胞裂解样品中P38α活性的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种细胞裂解萃取液样品（动物、人体）、部分或完全纯化酶样品中P38α激酶的定量检测，以及抑制剂和激活剂的筛选。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定，高度敏感。
技术背景
P38促分裂素原活化蛋白激酶（P38 mitogen-activated protein kinases；P38MAPK；EC2.7.11.24），又称为细胞分裂素特异性结合蛋白（Cytokinin Specific Binding Protein；CSBP），属于促分裂素原活化蛋白激酶（MAPK）一类中，包括JNK（c-Jun amino terminal kinase）、ERK（细胞外信号相关激酶；extracellular signal related kinase）、P38、Big MAPK1等的一员。酵母的同源基因为Hog1p。在哺乳动物细胞中，促分裂素原活化蛋白激酶通路包含有三大通路，P38信号通路是其中之一。P38MAPK属于丝氨酸//苏氨酸（serine/threonine）蛋白激酶家属。和ERK和JNK通路一起，将细胞外信号转化为特定细胞反应。P38通路受到各种促炎性刺激（proinflammatory stimuli）例如生长因子、激素、GPCR配体、促炎性细胞因子白介素1和8、肿瘤坏死因子α（TNF-α）等，以及细胞应激（UV、渗透压休克osmotic shock、内毒素、热休克、化学毒素等）而活化，通过MAPK激酶3和6（MKK3和6）、Jun N-terminal kinase kinase1，以及与MAP3k7IP1/TAB1反应，获得磷酸化后，由胞浆转移到胞核，进而激活下游MK2、MK3、PARK、Mac、MSK、MNK1、转录因子（STAT1、NFAT、ATF2、MEF2C、P53、CHOP、MAX、CDC25B）、MnSOD等，达到调节促炎性细胞因子的转译、各种细胞外刺激的基因表达、细胞周期、分化、凋亡的调节、TNFα、IL1、COX2的生物合成等功能。P38通路异常，将导致风湿性关节炎、炎症性肠病(inflammatory bowel disease, IBD)、银屑病（psoriasis）和癌症等，由此P38成为药物靶标。P38 MAPK蛋白激酶有5个亚酶，包括α（MAPK14/SAPK2A）、β（MAPK11）、γ（MAPK12/ERK6/SAPK3）、δ（MAPK13/SAPK4）、P38-2。其中P38α为广谱表达，由MAP激酶激酶（MKK）激活以及MAP3K7IP/TAB1蛋白反应后激活，其作用底物为ATF2、MEF2C、MAX、CDC2B、P53等，与细胞繁殖、分化、细胞周期、转录调节、炎性反应、细胞因子合成、发育（红细胞、胎盘）等有关；P38β为广谱表达，主要由MAP激酶激酶6（MKK6）激活，其作用底物为ATF2/CREB2；P38γ主要在骨骼肌组织表达，是成肌细胞（myoblast）分化为肌管（myotube）的信号传导者；P38δ在肺、胰腺、肾、小肠、睾丸等组织高表达，主要由MAP激酶激酶3和6（MKK3和6）激活，其作用底物为ATF2、Tau、Stathmin、eEF2K等，与角质形成细胞（keratinocyte）分化有关。P38α磷酸化目标序列为IPTTPITTTYFFFKKK。基于底物IPTTPITTTYFFFKKK，在P38α敏感性抑制剂SD169的存在与否的情况下，受到P38a激酶的磷酸化，获得产物磷酸化多肽，进而通过丙酮酸激酶（pyruvate kinase；PK）和乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase；LDH）反应系统中，还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide；NADH）转化为氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide；NAD），其吸光峰值的变化（340nm），来定量分析P38a激酶的活性。其反应方式为：
产品内容
YIJI清理液（Reagent A） 毫升
YIJI裂解液（Reagent B） 毫升
YIJI缓冲液（Reagent C） 毫升
YIJI酶促液（Reagent D） 微升
YIJI反应液（Reagent E） 微升
YIJI底物液（Reagent F） 微升
YIJI阴性液（Reagent G） 微升
YIJI专性液（Reagent H） 微升
产品说明书 1份
保存方式
保存YIJI清理液（Reagent A）在4℃冰箱里；其余的保存在－20℃冰箱里，严格避免光照和反复冻融；有效保证6月
用户自备
P38α激酶：用于抑制剂筛选
1.5毫升离心管：用于样品保存的容器
15毫升锥形离心管：用于样品处理的容器
细胞刮脱棒：用于贴壁细胞脱离
（微型）台式离心机：用于样品预处理
比色皿或96孔板：用于光度分析操作的容器
分光光度仪或酶标仪：用于样品光度分析
实验步骤
- 待测样品准备
- 准备好75cm2细胞培养瓶或100mm细胞培养皿的待测培养细胞（1至5 X 107细胞）
- 小心加入xx毫升YIJI清理液（Reagent A），覆盖生长表面
- 小心抽去清理液
- 使用细胞刮脱棒轻柔刮脱细胞（注意：避免使用胰酶消化）
- 加入xx毫升YIJI清理液（Reagent A），混匀细胞
- 移入到预冷的15毫升锥形离心管（注意：悬浮细胞从这一步骤开始）
- 放进4℃台式离心机离心5分钟，速度为300g
- 小心抽去上清液
- 加入xx微升YIJI裂解液（Reagent B），充分混匀
- 转移到预冷的1.5毫升离心管
- 强力涡旋震荡15秒
- 置于冰槽里孵育30分钟
- 放进4℃微型台式离心机离心5分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
- 小心移取500微升上清液到新的预冷的1.5毫升离心管
- 移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用YIJI Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－YJ30030.1）
- 即刻放进－70℃保存或置于冰槽里继续后续操作
- 测定准备
- 准备好待测样品（例如细胞裂解悬液等），置于冰槽里
- 设定好分光光度仪（温度为30℃）：波长为340nm，间隔1分钟，读数6次（共5分钟），并置零
- YIJI缓冲液（Reagent C）室温下均衡温度
- 背景对照测定
- 移取xx微升YIJI缓冲液（Reagent C）到新的比色皿
- 加入xx微升YIJI酶促液（Reagent D）
- 加入xx微升YIJI反应液（Reagent E）
- 加入xx微升YIJI底物液（Reagent F）
- 放进30℃培养箱里静置3分钟
- 加入xx微升YIJI阴性液（Reagent G）
- 上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）
- 即刻放进分光光度仪检测，此为背景空对照：340波长读数0分钟 －340波长读数5分钟
- 样品总活性测定
- 移取xx微升YIJI缓冲液（Reagent C）到新的比色皿
- 加入xx微升YIJI酶促液（Reagent D）
- 加入xx微升YIJI反应液（Reagent E）
- 加入xx微升YIJI底物液（Reagent F）
- 放进30℃培养箱里静置3分钟
- 加入5微升待测样品（注意：50微克细胞裂解蛋白；样品须溶解）
- 上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）
- 即刻放进分光光度仪检测，此为样品总活性读数：340波长读数0分钟 －340波长读数5分钟
- 样品非特异活性测定
检测开始前，移取xx微升YIJI缓冲液（Reagent C）到1.5毫升离心管，分别加入xx微升YIJI专性液（Reagent H）和待测样品（注意：50微克细胞裂解蛋白），混匀后，放进30℃培养箱里孵育30分钟。然后继续下列操作。
- 移取xx微升YIJI缓冲液（Reagent C）到新的比色皿
- 加入xx微升YIJI酶促液（Reagent D）
- 加入xx微升YIJI反应液（Reagent E）
- 加入xx微升YIJI底物液（Reagent F）
- 放进30℃培养箱里静置3分钟
- 加入20微升上述预处理的待测样品
- 上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）
- 即刻放进分光光度仪检测，此为样品非特异活性读数：340波长读数0分钟 －340波长读数5分钟
- 计算样品活性
- 样品总活性和非特异活性计算
2）样品特异活性计算
七、酶标仪测定
- 样品总活性测定
- 在96孔板上做好相应标记：背景对照和样品
- 分别移取xx微升YIJI缓冲液（Reagent C）到96孔板里
- 分别加入xx微升YIJI酶促液（Reagent D）
- 分别加入xx微升YIJI反应液（Reagent E）
- 分别加入xx微升YIJI底物液（Reagent F）
- 轻轻摇动96孔板
- 在30℃温度下孵育3分钟
- 分别加入xx微升YIJI阴性液（Reagent G）或待测样品（50微克细胞裂解悬液蛋白）到相应孔里（注意：样品须清澈）
- 轻轻摇动96孔板
- 即刻放进酶标仪检测：0分钟读数和5分钟读数
- 活性计算：
- 样品非特异活性测定
检测开始前，移取xx微升YIJI缓冲液（Reagent C）到1.5毫升离心管，分别加入xx微升YIJI专性液（Reagent H）和待测样品（注意：50微克细胞裂解蛋白），混匀后，放进30℃培养箱里孵育30分钟。然后继续下列操作。
- 在96孔板上做好相应标记：待测样品
- 移取xx微升YIJI缓冲液（Reagent C）到96孔板里
- 加入xx微升YIJI酶促液（Reagent D）
- 加入xx微升YIJI反应液（Reagent E）
- 加入xx微升YIJI底物液（Reagent F）
- 轻轻摇动96孔板
- 在30℃温度下孵育3分钟
- 加入20微升上述预处理的待测样品
- 轻轻摇动96孔板
- 即刻放进酶标仪检测：0分钟读数和5分钟读数
- 活性计算：
- 样品特异活性计算
八、抑制剂筛选
- 在96孔板上做好相应标记：背景、完全活性和待测抑制剂样品
- 按下表加入试剂，进行样品预处理
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内容物 |
空背景对照 |
样本背景 |
完全酶活性 |
待测抑制剂酶活性 |
|
YIJI缓冲液（Reagent C） |
xx微升 |
xx微升 |
xx微升 |
xx微升 |
|
YIJI阴性液（Reagent G） |
xx微升 |
xx微升 |
xx微升 |
—— |
|
待测抑制剂 |
—— |
xx微升 |
―― |
xx微升 |
|
用户自备的纯化酶 |
—— |
—— |
xx微升（1毫单位） |
xx微升（1毫单位） |
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96孔板每孔总量 |
空背景对照孔 （xx微升） |
样本背景孔 （xx微升） |
完全活性孔 （xx微升） |
待测抑制剂样品孔 （xx微升） |
|
轻轻摇动96孔板，混匀，放进30℃培养箱里孵育30分钟。然后进行下列操作 | ||||
- 分别移取xx微升YIJI缓冲液（Reagent C）到新的96孔板的所有孔里
- 分别加入xx微升YIJI酶促液（Reagent D）
- 分别加入xx微升YIJI反应液（Reagent E）
- 分别加入xx微升YIJI底物液（Reagent F）
- 轻轻摇动96孔板
- 在30℃温度下孵育3分钟
- 加入20微升上述预处理的待测样品
- 即刻放进30℃酶标仪检测：测读30分钟
- 抑制活性计算：
注意事项
- 本产品为20次操作
- 操作时，须戴手套
- 系统操作过程中，背景测定只需1次
- 样品处理忌用磷酸缓冲溶液
- 样品须澄清，至关重要
- 如果出现明显的干扰现象，建议使用样本背景对照去除任何内源性干扰因子
- 加入样品启动反应后3秒内即刻光度测定
- 测定值由高到低变化；测定可持续30分钟
- 光度测定后，比色皿须清洗彻底
- 样本测定0分钟读数高于5分钟读数表明具有酶活性
- 建议待测样本蛋白浓度为50微克/5微升（本公司提供 YIJI Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－YJ30030.1）
- 如果待测样品浓度过高或过低，可以调整样品浓度
- 可以使用P38α抑制剂（VX745；IC50=10纳摩尔）作为抑制剂对照或阴性对照
- P38α激酶活性单位浓度定义：在30℃温度下，pH 7.6条件下，每分钟内能够氧化1微摩尔还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）所需的酶量作为一个活性单位
- 本公司提供系列蛋白激酶检测试剂产品
质量标准
- 本产品经鉴定性能稳定
- 本产品经鉴定检测敏感
