组织乙酰胆碱酯酶活性比色法定量检测试剂盒产品说明书

组织乙酰胆碱酯酶活性比色法定量检测试剂盒产品说明书（中文版）

主要用途

组织乙酰胆碱酯酶活性比色法定量检测试剂是一种旨在通过乙酰胆碱酯酶反应系统中释放出巯基胆碱，使用Ellman试剂后，产生黄色5-巯基-2-硝基苯甲酸产物，出现吸光峰值的变化，即采用比色法来测定细胞裂解样品中酶活性的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种组织裂解悬液样品（动物、人体等）乙酰胆碱酯酶的活性检测。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定。

 

技术背景

 

乙酰胆碱酯酶（Acetylcholinesterase；AchE；EC3.1.1.7），又称为红细胞胆碱酯酶（RBC cholinesterase），广泛存在于真核生物，包括某些植物，尤其在脑组织、神经肌肉连接处（neuromuscular junction）、中枢神经系统的胆碱能突触（cholinergic synapses）和红细胞膜上高度表达，催化主要的神经传导介质乙酰胆碱的水解反应，产生乙酸和胆碱，终止突触传导。其功能在于调节乙酰胆碱作用。神经毒气，例如有机磷沙林（Sarin），抑制乙酰胆碱酯酶活性，导致神经肌肉瘫痪，最终发生窒息（asphyxiation）。血清乙酰胆碱酯酶浓度显著降低与有机磷杀虫剂中毒有关，因此血液检测是环境污染的重要指标。基于人工合成底物碘化硫代乙酰胆碱（acetylthiocholine iodide）在乙酰胆碱酯酶的作用下，水解产生乙酸和硫代胆碱（thiocholine），与Ellman试剂5,5-二硫基-双（2-硝基苯甲酸）[5,5’-dithiobis-（2-nitrobenzoic acid）；DTNB]反应后，产生黄色的5-巯基-2-硝基苯甲酸（5-thio-2-nitrobenzoic acid；TNB），通过其吸收峰值的变化（412nm波长），来定量分析乙酰胆碱酯酶的活性。乙酰胆碱酯酶反应系统为：

    Acetylcholinesterase 

acetylthiocholine iodide        →      acetate  +  thiocholine

                             

DTNB  +  thiocholine  →   TNB +  choline-S-S-TNB

 

产品内容

 

清理液（Reagent A）  60毫升

裂解液（Reagent B）  10毫升

缓冲液（Reagent C）  40毫升

反应液（Reagent D）   2毫升

底物液（Reagent E）       4毫升

阴性液（Reagent F）     2毫升

产品说明书      1份

 

保存方式

 

保存裂解液（Reagent B）、反应液（Reagent D）和底物液（Reagent E）在－20℃冰箱里；其余的保存在4℃冰箱里；反应液（Reagent D）和底物液（Reagent E）避免光照；有效保证6月

用户自备

 

1.5毫升离心管：用于样品制备和保存的容器

15毫升锥形离心管：用于样品制备的容器

微型台式离心机：用于样品制备

比色皿或96孔板：用于比色的容器

分光光度仪或酶标仪：用于比色分析

 

实验步骤

 

• 样品准备

 

• 手术取出动物组织，并秤重以确定500毫克组织重量 
• （选择步骤）放进预冷的15毫升锥形离心管
• （选择步骤）加入3毫升清理液（Reagent A）清洗1次
• 移入到一个液氮冻存管
• 即刻放进液氮罐过夜
• 次日从液氮罐里取出，即刻（最快速度）用研磨棒碾碎组织成粉末状（注意：切莫使组织冻融）
• 放进一个15毫升锥形离心管
• 加入预冷的500微升裂解液（Reagent B） 
• 转移到预冷的1.5毫升离心管
• 强力涡旋震荡30秒，充分混匀
• 置于冰槽里孵育30分钟，期间每10分钟强力涡旋震荡30秒（注意：如需暂时停止，放进－70℃冰箱里储存备用）
• 放进4℃微型台式离心机离心5分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取500微升上清液到新的预冷的1.5毫升离心管
• 移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－30030.1）
• 即刻放进－70℃保存或置于冰槽里继续后续操作

 

• 测定准备

 

• 开启并设定好分光光度仪（温度为37℃）：波长412nm，间隔5分钟，读数3次（共15分钟），并置零
• 从－20℃冰箱里取出试剂，置于冰槽里融化；反应液（Reagent D）和底物液（Reagent E）避免光照
• 缓冲液（Reagent C）室温下均衡温度；底物液（Reagent E）50℃温育溶解

 

• 样品背景对照测定

 

• 移取750微升缓冲液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入100微升阴性液（Reagent F）
• 加入100微升底物液（Reagent E）
• 上下倾倒数次，混匀
• 在37℃温度下孵育3分钟
• 加入50微升待测样品（100微克蛋白）（注意：样品须清澈） 
• 上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）
• 即刻放进分光光度仪检测，此为样品背景对照（15分钟读数－0分钟读数）

 

• 样品测定

 

• 移取750微升缓冲液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入100微升反应液（Reagent D）
• 加入100微升底物液（Reagent E）
• 上下倾倒数次，混匀
• 在37℃温度下孵育3分钟
• 加入50微升待测样品（100微克蛋白）（注意：样品须清澈）
• 上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）
• 即刻放进分光光度仪检测，此为样品读数（15分钟读数－0分钟读数）

 

五、计算样品活性

 

[（样品读数－背景读数）X 1（体系容量；毫升）X样品稀释倍数]÷[0.05（样品容量；毫升）X 13.6（毫摩尔吸光系数）X 15（反应时间；分钟）]＝单位/毫升÷（样品蛋白浓度）毫克/毫升＝单位/毫克

 

单位＝微摩尔硫代胆碱/分钟

 

• 酶标仪测定

 

• 在96孔板上做好相应标记：样品背景对照和待测样品
• 分别移取190微升缓冲液（Reagent C）到96孔板里
• 加入25微升阴性液（Reagent F）到样品背景对照孔里
• 加入25微升反应液（Reagent D）到待测样品孔里
• 分别加入25微升底物液（Reagent E）到所有孔里
• 轻轻摇动96孔板
• 在37℃温度下孵育3分钟
• 分别加入10微升待测样品（20微克蛋白）到所有孔里（注意：样品须清澈）
• 轻轻摇动96孔板
• 即刻放进酶标仪检测：0分钟读数和15分钟读数

 

[（样品读数－背景读数）X样品稀释倍数X 0.25（体系容量；毫升）]÷[0.01（样品容量；毫升）X 13.6（毫摩尔吸光系数）X 0.6（光径距离；厘米）X 15（反应时间；分钟）]＝单位/毫升÷（样品蛋白浓度）毫克/毫升＝单位/毫克

 

单位＝微摩尔硫代胆碱/分钟

 

 

 

注意事项

 

• 本产品为20次（比色皿）和80次（96孔板）操作 
• 操作时，须戴手套
• 每个样品均须背景测定
• 建议使用比色皿测定
• 样品须澄清，至关重要
• 加样后3秒内比色测定
• 测定值由低到高变化；测定可持续15分钟
• 比色测定后，比色皿须清洗彻底
• 样本测定15分钟读数高于0分钟读数表明具有酶活性
• 建议待测样本蛋白浓度为100微克/50微升（本公司提供  Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－30030.1）
• 如果待测样品浓度过高或过低，可以调整样品浓度
• 乙酰胆碱酯酶单位活性定义为：在37℃，pH 7.5条件下，每分钟内能够生成1微摩尔硫代胆碱所需的酶量作为一个活性单位
• 本公司提供系列乙酰胆碱酯酶检测试剂产品

 

质量标准

 

• 本产品经鉴定性能稳定
• 本产品经鉴定检测敏感