人烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)ELISA试剂盒操作说明

人烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)ELISA试剂盒操作说明

l 本试剂盒用于体外定量检测血清、血浆、组织、细胞上清及相关液体样本中人烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)的含量。

l 有效期：6个月

l 保存条件：2-8℃

人烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)ELISA试剂盒实验原理

试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被人烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)捕获抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的人烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)呈正相关。用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度（OD 值），计算样品浓度。

人烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)ELISA试剂盒样本处理及要求

1.  血清：全血标本请于室温放置2小时或4℃过夜后于1000g离心20分钟，取上清即可检测，或将标本放于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。
2.  血浆：可用EDTA或肝素作为抗凝剂，标本采集后30分钟内于2 - 8°C 1000g离心20分钟，或将标本放于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。
3.  细胞培养物上清或其它生物标本：1000g离心20分钟，取上清即可检测，或将标本放于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。
注：标本溶血会影响最后检测结果，因此溶血标本不宜进行此项检测。

需要而未提供的试剂和器材

• 酶标仪（450nm）
• 高精度加样器及枪头：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL
• 37℃恒温箱
• 蒸馏水或去离子水

注意事项

• 严格按照规定的时间和温度进行温育以保证准确结果。所有试剂都必须在使用前达到室温20-25℃。使用后立即冷藏保存试剂。
• 洗板不正确可以导致不准确的结果。在加入底物前确保尽量吸干孔内液体。温育过程中不要让微孔干燥掉。
• 消除板底残留的液体和手指印，否则影响OD值。
• 底物显色液应呈无色或很浅的颜色，已经变蓝的底物液不能使用。
• 避免试剂和标本的交叉污染以免造成错误结果。
• 在储存和温育时避免强光直接照射。
• 平衡至室温后再打开密封袋以防水滴凝聚在冷板条上。
• 任何反应试剂不能接触漂白溶剂或漂白溶剂所散发的强烈气体。任何漂白成分都会破坏试剂盒中反应试剂的生物活性。
• 不能使用过期产品。
• 如果可能传播疾病，所有的样品都应管理好，按照规定的程序处理样品和检测装置。

试剂准备

试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡后方可使用。

20×洗涤缓冲液的稀释：蒸馏水按1：20稀释，即1份20×洗涤缓冲液加19份蒸馏水。

操作步骤

1.   从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。
2.   设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；
3.   样本孔中加入待测样本50μL；空白孔不加。
4.   除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。
5.   弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（350μL），静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。
6.   每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。
7.   每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。

实验结果计算

以所测标准品的OD值为横坐标，标准品的浓度值为纵坐标，在坐标纸上或用相关软件绘制标准曲线，并得到直线回归方程，将样品的OD值代入方程，计算出样品的浓度。

试剂盒性能

•  检测范围：3.75 ng/mL – 120 ng/mL。
•  灵敏度：最低检测浓度小于0.1 ng/mL。
•  特异性：不与其它可溶性结构类似物交叉反应。
•  重复性：板内变异系数小于10% ，板间变异系数小于15% 。

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