蛋白质组学几种定量方法的案例解读

  上期分享的蛋白组学内容，是不是有些小伙伴还绕在云里雾里呀？这次，小编用实例说话，帮您梳理清楚。

一、Label-free定量

  Label-free定量，顾名思义就是不需要对比较样本做特定标记处理，只需要比较特定肽段/蛋白在不同样品间的色谱质谱响应信号便可得到样品间蛋白表达量的变化，通常用于分析大规模蛋白鉴定和定量时所产生的质谱数据。

  Label-free技术又可分为基于谱图数（Spectra Count，简称SC）和基于肽段母离子强度（或色谱离子流的峰面积即XIC）两种方法，后者更准确，使用更广泛。

技术特点

无需标记，操作简单；

不受比较样品数限制；

对实验操作稳定性、重复性要求高；

准确性较标记定量差；

要求至少做三次技术重复或生物重复。

适用范围

适合大样本量的定量比较；

对无法用标记定量实现的实验设计，易用label-free技术；

经典案例

题目：Label-free global serum proteomic profiling reveals novel celecoxib-modulated proteins in familial adenomatous polyposis patients（利用Label-free定量技术进行家族性腺瘤息肉病患者血清的全蛋白质组分析，寻找Celecoxib调控蛋白）

期刊：Cancer genomics proteomics

主要技术：Label-free定量

文章摘要：Celecoxib是一种环氧合酶选择性抑制剂，能够对患有预防家族性腺瘤性息肉病（FAP)和散发性大肠癌的病人进行防治。为了识别其具体的作用机制，本文采用多维色谱分离方法结合电喷雾串联质谱，使用Label-free定量技术，比较经Celecoxib处理前、后血清样品的蛋白质组表达量差异。发现了83个可能为Celecoxib响应的表达量显著差异蛋白。通过Western blotting方法，在FAP病人和结肠直肠癌细胞系中进一步确认了一些Celecoxib调控蛋白，为进一步进行Celecoxib作用机制的大规模临床试验奠定了基础。

图：Apo A-II蛋白中特征肽的定量结果比较

注：AB为处理前，CD为处理后

Fatima N, Chelius D et al. Label-free global serum proteomic profiling reveals novel celecoxib-modulated proteins in familial adenomatous polyposis patients. Cancer genomics proteomics.

文献来源：Fatima N, Chelius D, Luke BT, Yi M, Zhang T, Stauffer S, Stephens R,Lynch P, Miller K, Guszczynski T et al: Label-free global serum proteomic profiling reveals novel celecoxib-modulated proteins in familial adenomatous polyposis patients. Cancer genomics proteomics 2009, 6(1):41-49.

二、iTRAQ定量

iTRAQ(isobaric tags for relative and absolute quantitation，同重同位素标签标记的相对和绝对定量)技术也是目前定量蛋白质组学中应用最广泛的技术。

  iTRAQ试剂分为报告基团、平衡基团和肽反应基团。报告基团共有8种（113、114、115、116、117、118、119、121 Da)。肽反应基团能与肽链N端及赖氨酸侧链发生共价链接，从而将报告基团和平衡基团标记在肽段上；平衡部分质量分别为192~184，与报告部分相加正好为305。

  在一级质谱图中，任何一种iTRAQ试剂标记不同样本中的同一蛋白质表现为相同的质荷比。在二级质谱中，iTRAQ试剂中的平衡基团发生中性丢失，信号离子表现为不同质荷比(113~121) 的峰，根据波峰的高度及面积，可以得到同一蛋白在不同样本中的表达差异；同时，肽段的MS/MS结果结合数据库检索可以鉴定出相应的蛋白种类。

技术特点

灵敏度高：可检测出较低丰度蛋白，胞浆蛋白、膜蛋白、核蛋白、胞外蛋白等；

分离能力强：可分离出酸/碱性蛋白，小于10K或大于200K的蛋白、难溶性蛋白；

高通量：可同时对8个样本进行分析，特别适用于采用多种处理方式或来自多个处理时间的样本的差异蛋白分析；

结果可靠准确：定性与定量同步进行，同时得出鉴定和定量结果。

自动化程度高：液质连用，自动化操作，分析速度快，分离效果好。

适用范围

适用于任何类型的样本；

一次最多能标记8个样本；

经典案例

题目：A tumour suppressor network relying on the polyamine-hypusine axis（一种基于多胺Hypusine轴（Polyamine-hypusine axis）的新型肿瘤抑制网络）

期刊：Nature

主要技术：iTRAQ定量

文章摘要：为寻找淋巴瘤的抑癌基因，首先通过筛选短发夹RNA文库的方法，识别出一些抑制后会引起小鼠淋巴瘤模型肿瘤扩增的基因。然后采用iTRAQ定量技术对两个有意义的淋巴瘤抑癌基因——AMD1和Eif5A的表达调控进行研究，发现这两个基因都与Hypusine(Hypusine是一种独特的氨基酸，由一种高保守途径产生的多胺代谢产物)相关。通过进一步的二次筛选，确定了多胺Hypusine轴的新型抑癌基因网络，这一网络能调控细胞凋亡。

     

图：iTRAQ定量流程和蛋白质比值分布图

Scuoppo C, Miething C et al. A tumour suppressor network relying on the polyamine-hypusine axis. Nature.

文献来源：Scuoppo C, Miething C, Lindqvist L, Reyes J, Ruse C, Appelmann I,Yoon S, Krasnitz A, Teruya-Feldstein J, Pappin D et al: A tumour suppressor network relying on the polyamine-hypusine axis. Nature2012, 487(7406):244-248.

三、SILAC定量

  SILAC（Stable Isotope Labeling Strategies,稳定同位素标记技术）为全面、系统地定性和定量分析复杂哺乳动物细胞蛋白质组提供了有效的方案。

  SILAC的基本原理是分别用天然同位素(轻型)或稳定同位素(中性或重型)标记的必需氨基酸取代细胞培养基中相应氨基酸，细胞经5-6个倍增周期后，稳定同位素标记的氨基酸完全掺入到细胞新合成的蛋白质中替代了原有氨基酸。不同标记细胞的裂解蛋白按细胞数或蛋白量等比例混合，经分离、纯化后进行质谱鉴定，根据一级质谱图中两个同位素型肽段的面积比较进行相对定量，属于体内代谢标记法。

技术特点

高效性：SILAC是体内标记技术，标记效率可高达100%；

定量精确，线性范围广，降低由于样品制备、实验操作和仪器设备造成的实验误差，定量重复性好；

体内代谢标记与SDS-PAGE或色谱分离技术相结合，兼容疏水性蛋白和偏碱性蛋白，不受蛋白性质限制；

由于该技术属于体内标记，标记效果稳定，其标记效率不受裂解液的影响，不仅适合于进行全细胞蛋白的分析，还适合于膜蛋白的鉴定和定量；

与化学标记相比，SILAC方法蛋白需要量明显减少，通常每个样品只需要几十微克的蛋白量；

活体标记，更接近样品真实状态；

相容性：可以对多种在DMEM或RPMI 1640培养基中能够培养的细胞或细菌中表达的蛋白进行标记。

适用范围

只适用于活体培养的细胞，对于生物医学研究中常用的组织样品、体液样品等无法分析。

经典案例

题目：Proteome-wide Mapping of Cholesterol-Interacting Proteins in Mammalian Cells（采用甾醇探针结合SILAC定量技术在哺乳动物细胞中分析胆固醇-蛋白质相互作用）

期刊：Nat Methods

主要技术：SILAC定量

文章摘要：胆固醇是细胞膜的重要结构成分，也是前体的信号分子，在很大程度上通过与蛋白质的特异性相互作用调控参与发挥其作用。本文采用可点击的光敏甾醇探针结合SILAC蛋白质组定量技术直接在活体细胞中全面解析了胆固醇-蛋白相互作用。最终确定了超过250个胆固醇结合蛋白，包括受体、通道蛋白和涉及许多已建立和之前未报告相互作用的酶。新发现的蛋白质相互作用中最突出的是调节糖、甘油脂和胆固醇本身以及参与囊泡运输和蛋白质糖基化和降解蛋白质的酶。这些蛋白指向关键节点的生化途径，说明甾醇浓度和其他代谢物的控制可能和蛋白定位以及修饰高度相关。

   

           图：实验基本流程           图：胆固醇生物合成通路

                 

注：黑色字符蛋白表示没有鉴定         

Jonathan J et al. Proteome-wide Mapping of Cholesterol-Interacting Proteins in Mammalian Cells. Nature methods.                                                                             

文献来源：Jonathan J, Armand B, Micah J, Sarah E, Benjamin F: Proteome-wide Mapping of Cholesterol-Interacting Proteins in Mammalian Cells.Nature methods, 2013 March; 10(3):259-264.

四、SWATH定量

  SWATH（Sequential Window Acquisition of all Theoretical Mass Spectra）是瑞士苏黎世联邦理工学院的Ruedi Aebersold 博士及其团队与AB-SCIEX于2012年联合推出的一项全新的质谱采集模式技术，是 MS/MSALL技术的一种扩展。它将扫描范围划分为以25 Dalton为间隔的一系列区间，通过超高速扫描来获得扫描范围内全部离子的所有碎片信息。

技术特点

灵敏度高：SWATH技术继承了MRM的数据采集模式，结合高分辨率的AB sciex Triple TOF-plus，具有与MRM相当的灵敏度；

可重现性高：重复样品间的定量相关性可达0.99以上；

线性动态范围广：定量范围可跨越4个数量级；

通量大：一次实验可检测到2000种以上蛋白并定量。

适用范围

最好检测细菌等复杂度较低的样品；

可以和MRM技术联合使用发现生物标志物；

可以和TAP技术联合使用鉴定相互作用蛋白。

经典案例

题目：SWATH-and iTRAQ-based quantitative proteomic analyses reveal an overexpression and biological relevance of CD109 in advanced NSCLC (利用SWATH和iTRAQ定量技术揭示CD109在晚期非小细胞肺癌的过表达和生物相关性)

期刊：Journal of proteomics

主要技术：SWATH、iTRAQ

文章摘要：文章采用iTRAQ和SWATH定量技术，对癌细胞高转移和低转移非小细胞肺癌细胞系中蛋白的表达量变化（分别与正常状态比较）进行了分析。分别在细胞系分泌蛋白组和非小细胞肺癌血清中找到110个和71个存在显著差异的蛋白。研究者发现，在这些差异蛋白中，CD109在高度转移的细胞系分泌蛋白组和癌症晚期患者组都有较高的表达量，ELISA检测也得到相同的结论。另外，和正常肺细胞比较，CD109在肺癌细胞中也高度表达。研究者还发现，敲出CD109蛋白会影响NSCLC细胞的生物功能，如抑制细胞生长、影响细胞循坏阶段等。这些现象表明，CD109在NSCLC的进程中扮演着重要角色，很有可能是肺癌发病一个关键的生物标志物。

 

图：SWATH定量蛋白表达量比值分布

iTRAQ定量和SWATH定量蛋白比值相关性分布