ELISA常见问题及解决方案
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一．背景高或者非特异性染色 | |
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原因 |
解决方案 |
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抗体的非特异性结合 |
更换封闭液（例如，使用酪蛋白替代BSA）；封闭结束后不要清洗；倒出封闭液，吸水纸上吸干残留液体后直接进行下一步。 |
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未充分清洗酶标板 |
确保在清洗过程中每个微孔都充满缓冲液、清洗仪器正常工作。各步骤之间清洗3~5次，不要增加清洗次数。清洗完成后，将酶标板用力按压在纸巾上，以除去残余的缓冲液。清洗溶液中应添加适量的Tween-20（推荐浓度0.01-0.1%）。 |
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缓冲液被污染 |
缓冲液应新鲜配制，一周内使用，并过滤除菌。 |
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孵育温度太高 |
整个实验过程应在室温25℃。 |
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孵育时间过长 |
缩短孵育时间 |
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酶标记物污染了底物或者阳性对照污染了微孔 |
吸取不同的试剂时应更换吸头，并使用不同的贮液器。最好用移液器加入或去除清洗缓冲液（倒入/倒出可能导致交叉污染）。 |
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检测抗体或Avidin-HRP的浓度过高 |
检测浓度计算是否正确，或者进一步稀释后再使用。 |
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底物在使用前曝光 |
在将底物加入到微孔中以前，应始终避光保存 |
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读取吸光值时使用了错误的滤光片 |
ABTS为底物时应在405nm波长读取吸光值（TMB为底物时应在450nm波长读取吸光值），并以650nm作为校正波长。 |
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显色时间过长 |
每5分钟读取一次吸光值，以监测空白孔的O.D.读数。 |
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二．显色弱或者不显色 | |
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原因 |
解决方案 |
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遗漏了某种试剂或某个步骤 |
查看实验方案，严格遵循实验操作步骤。 |
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清洗缓冲液中的去污剂浓度过高 |
去除或降低去污剂的浓度，推荐0.01-0.1% |
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酶标板未适当清洗 |
减少各步骤之间的清洗次数，尤其是当未使用全自动或半自动洗板机时，清洗1-2次即可。 |
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样本中存在酶抑制剂 |
叠氮钠抑制了过氧化物酶的活性。 |
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孵育时间或温度错误 |
孵育期间应将酶标板放在孵育箱（25℃）内，以免出现温度波动 |
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加入微孔中的底物量有误 |
检查移液器 |
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酶-底物系统不合适 |
Avidin-HRP和ABTS配对使用，Streptavidin和TMB配对使用 |
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试剂盒内的组分储存不当 |
按说明书要求储存各组分 |
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读取吸光值时使用了错误的滤光片 |
ABTS为底物时应在405nm波长读取吸光值（TMB为底物时应在450nm波长读取吸光值），并以650nm作为校正波长 |
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三．标准曲线不佳 | |
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原因 |
解决方案 |
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标准品配制有误 |
使用推荐的稀释缓冲液对标准品进行稀释 |
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过早稀释 |
使用前再配制各种试剂，并尽快使用 |
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捕获抗体无法包被 |
使用适合做ELISA的板，不能用细胞培养板 |
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清洗不充分 |
每个微孔中应加入等体积清洗液，确保所有微孔均可被抽吸干净，并及时填充。 |
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移液出错 |
校正移液器，快速、等量的将移液器中的试剂沿微孔的侧壁加入 |
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显色时间过长 |
空白孔的O.D.读数不超过0.2或最高浓度标准品孔的O.D.读数不超过1.2。 |
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试剂盒内的组分储存不当 |
按说明书要求储存各组分，不要将重悬后的试剂在室温放置时间过长。 |
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四.精确度较差 | |
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原因 |
解决方案 |
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试剂混合不充分 |
移液前，充分混合试剂 |
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清洗不充分 |
每个微孔中应加入等体积清洗液，确保所有微孔均可被抽吸干净，并及时填充。 |
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移液出错 |
校正移液器，快速、等量的将移液器中的试剂沿微孔的侧壁加入 |
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耗材重复使用 |
吸取不同样本时应更换吸头；不同的试剂使用不同的贮液器；个孵育时段内应用新的密封片封板。 |
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微孔被吸头或洗板机划伤 |
吸液、加液时小心操作 |
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样本中存在沉淀物 |
使用前应离心样本管 |
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微孔不干净或存在污垢 |
使用前仔细检查微孔，并清除污垢。读取吸光值前，请擦拭酶标板的底部，以去除污垢或指纹。 |
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五.边缘效应 | |
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原因 |
解决方案 |
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蒸发 |
每个孵育步骤都应使用密封片封板 |
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温度不均匀 |
孵育期间应将酶标板放在孵育箱（25℃）内，以免温度波动，请勿堆叠酶标板。 |
植物elisa试剂盒大全：http:///cn/tech/2013/8-15/tech_57126682.htm
