全基因组扩增技术介绍

研究人员通常会在下游分析中遭遇DNA样本量有限或不足的问题。QIAGEN的全基因组扩增技术通过以包括单细胞在内的小量样本或珍贵样本扩增获得基因组DNA，解决此类难题。REPLI-g Kit能够准确地复制原始DNA样本，不会造成偏差，扩增后的DNA可以直接应用于广泛的遗传学分析。

什么是全基因组扩增(whole gemome amplification)？
做为一种增加有限DNA量的方法，全基因组扩增技术于1992年出现，该方法特别适于法医学鉴定和遗传疾病的研究，以及如二代测序技术和CGH阵列（比较基因组杂交）等新技术应用，后者的主要难题就在于DNA样本数量有限，但分析需求量又很可观。目前业界已经开发出多种WGA技术，它们之间的实验方案和复制准确度有所不同。

WGA技术——PCR技术与多重置换扩增（MDA）技术的比较 
业界已经开发出多种WGA技术；不过这些技术在其扩增准确性和易用性等方面有所区别。QIAGEN的REPLI-g Kit采用被称为多重置换扩增的WGA技术，能够提供无偏差的准确全基因组扩增。 

基于PCR的WGA技术

基于PCR的WGA技术主要有两种：简并寡核苷酸PCR (DOP-PCR)技术(1)和扩增前引物延伸(PEP)技术(2)。这两种技术之间的主要区别在于PEP技术使用随机引物和低PCR退火温度，而DOP-PCR技术则使用半简并寡核苷酸（例如CGACTCGAGNNNNNNATGTGG）和更高的退火温度。两种方法中都使用了Taq DNA聚合酶，使得扩增长度限制在3 kb（平均片段长度为400–500 kb）以内，并且会在扩增序列中引入一些错误。不仅如此，有研究发现这些技术的基因组覆盖度不够完整，并会在扩增中产生偏向性——由于引物优先结合某些特定区域，造成DNA扩增产物中的一些序列相对增多。

多重置换扩增的WGA技术

REPLI-g使用了称为多重置换扩增(MDA)的恒温基因组扩增技术，该技术包含了随机六聚体与变性DNA的结合过程，以及使用Phi 29聚合酶在恒定温度下进行的链置换合成过程。每个置换链上添加引物后，形成分枝状的DNA结构网络。Phi 29聚合酶不会从基因组DNA模板上面解离下来，这使得生成的无偏差DNA片段可延伸至100 kb。该酶还具有3’端→5’端的外切酶校正活性，相比基于Taq DNA聚合酶的方法，能够提供高达1000倍的保真度（参见上述基于PCR的WGA技术）。Phi 29聚合酶由独特的REPLI-g优化缓冲液进行支撑，能够方便的克服如发卡环一类的二级结构困难，在扩增过程中避免滑脱、定制和聚合酶解离等现象的发生。这样无偏差的DNA片段能够合成至100 kb的长度。 

MDA技术与基于PCR的WGA方法相比的优势

传统的基因组DNA扩增方法包括费时的EBV转化细胞系建立过程，以及之后使用随机或简并寡核苷酸引物进行的PCR全基因组扩增步骤。为其他厂商所普遍采用的基于PCR的WGA法，也会产生非特异性的扩增干扰以及不完全的位点覆盖度。某些案例中可能生成短于1 kb长度的DNA片段，在很多后续应用中无法使用。通常情况下，由于使用了低保真度的Taq DNA聚合酶，使生成的DNA中包含了很高的碱基突变率，因此形成了容易出错的扩增，导致如单碱基对突变、STR缩短和扩张等不良后果的发生。REPLI-g则没有这些缺点，它能对整个基因组进行高度均一的扩增，反应过程中位点序列的偏差及突变率达到最小。

WGA技术的应用
使用REPLI-g扩增后的基因组DNA适于进行多种多样的后续应用，包括：

• 使用TaqMan引物/探针套装进行SNP基因分型
• 基于qPCR和PCR技术的突变检测
• 二代测序
• STR/微卫星序列分析
• Sanger测序
• RFLP和Southern印迹分析
• 如比较基因组杂交一类的芯片分析技术

以上信息来源于QIAGEN:http://www.qiagen.com/cn/resources/technologies/wga/overview-on-wga/

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www.liankebio.com；