质粒DNA质量如何评估才可靠？

浏览次数：6044　发布日期：2015-1-11　来源：本站　仅供参考，谢绝转载，否则责任自负

质粒抽提过程中有很多步骤会影响最后的产量和质量，那么如何评估质粒DNA的产量和质量呢？

目前使用分光光度法定量质粒DNA和通过琼脂糖凝胶电泳进行质粒DNA产率和质量的分析是两种最常用的方法。

溶液中的核酸浓度可通过260 nm的吸光度方便地进行计算。A260的数值处于0.1至1.0之间时测量结果具有良好的重复性，但当A260数值小于0.1或大于1.0的时候，结果的可重复性将显著下降。而且，3.0以上的读值是无法使用的，它可能会潜在导致对DNA质量的低估。因此，为了获得可靠的DNA分光光度定量结果，A260的读值需要处于0.1至1.0之间。当检测小量DNA时，使用琼脂糖凝胶电泳进行的定量分析可能更为可靠。

造成较低的产率和质量的可能因素有很多。为了确定存在问题的环节，可于每一纯化步骤都保留一小部分样品，并通过琼脂糖凝胶电泳进行分析。

制备样本

如各个实验方案和下列表格中所示，从澄清裂解液（样本1）、流出液（样本2）、QC洗涤缓冲液的混合组分（样本3）和QF/QN缓冲液洗脱产物（样本4）中各取出部分样品。使用1倍体积的异丙醇沉淀核酸，并使用70%的乙醇洗涤该沉淀，充分蒸干后重悬于10 µl pH8.0的TE缓冲液中。

表一琼脂糖凝胶分析所需样本体积

样本	实验方案步骤	Midi	Maxi	Mega	Giga	（极低拷贝数质粒/科斯质粒） QIAGEN-tip 100	（极低拷贝数质粒/科斯质粒）QIAGEN-tip 500
1		240 µl	120 µl	120 µl	75 µl	600 µl	750 µl
2		240 µl	120 µl	120 µl	75 µl	50 µl	24 µl
3		400 µl	240 µl	160 µl	120 µl	200 µl	120 µl
4		100 µl	60 µl	22 µl	20 µl	50 µl	30 µl
(制备产物占样本量的百分比)		2%	0.40%	0.08%	0.02%	1%	0.20%

琼脂糖凝胶分析

在1%的琼脂糖凝胶*中，对于各个质粒纯化步骤中的对应样品各加入2 µl进行电泳。

以上信息来源于：

http://www.qiagen.com/cn/resources/technologies/plasmid-resource-center/reliability%20of%20dna%20quantification%20by%20spectrophotometry/

http://www.qiagen.com/cn/resources/technologies/plasmid-resource-center/agarose%20gel%20analysis%20of%20the%20purification%20procedure/