三维细胞培养技术及其相关载体的研究进展及应用

 

自WillhelmRoux于1885年从鸡胚中分离细胞首次建立体外细胞培养, 单层细胞培养技术已有百余年的历史。一个多世纪以来,单层细胞培养有了蓬勃的发展, 特别是在制药或者疫苗合成等产业化领域, 通过细胞的快速分裂,从而高效率地制造产品。但在生命科学基础研究领域, 对于细胞的体外培养, 关注的不仅仅是它们的分裂生长,而更为重要的是它们经过传代后能否维持体内的性状。在很多情况下, 单层细胞培养技术所取到的研究结果和体内的情况不符合,因为细胞在体外改变的环境下增生, 逐渐丧失了原有的性状。动物实验完全在体内进行,但由于体内的多种因素制约以及体内和外界环境相互影响而变得复杂化, 难以研究单一过程。另外, 我们在动物身上所观察到的结果,往往是最终呈现的表现, 而非研究者最为关心的中间过程。显然, 如何填补单层细胞培养和动物实验的鸿沟,一直是生命科学家思索的问题。尤其是在发育生物学领域, 迫切需要建立一套细胞培养技术, 既能生长传代, 还能最大程度地维持体内性状,并分化产生新的组织结构, 以便全面研究发育过程。随着组织工程的新兴发展, 三维细胞培养技术就应运而生了。

 

体外细胞培养的一个重要原则是需模拟体内细胞生长环境,该模拟系统中最重要的核心因素是细胞与培养环境之间的相互作用。不同于传统的二维化单层细胞培养, 三维细胞培养技术(three-dimensional cell culture, TDCC)是指将具有三维结构的不同材料的载体与各种不同种类的细胞在体外共同培养, 使细胞能够在载体的三维立体空间结构中迁移、生长,构成三维的细胞-载体复合物。三维细胞培养是将细胞培植在一定的细胞外基质中, 细胞外基质( extracellular matrix,ECM) 蛋白充当生长支架, 使得细胞能够分化产生一定的三维组织特异性结构, 所创建的细胞生长环境,则最大程度地模拟体内环境。TDCC作为体外单层细胞系统的研究与组织器官及整体研究的桥梁,显示了它既能保留体内细胞微环境的物质及结构基础,又能展现细胞培养的直观性及条件可控性的优势。近几年三维细胞培养技术在组织形成、血管发育和器官再造等发育生物学的分支领域得到了广泛的应用;同时在筛选新药的疗效分析和毒理实验方面, 利用三维培养获得了和二维单层培养完全不同的结果, 引起了药物学家的极大兴趣。

 

细胞赖以生存的三维空间，其功能是为细胞提供生存空间，使细胞获得足够的营养物质进行气体交换，并使细胞按预制形态的三维支架生长，成为使细胞生长良好的三维界面。理想的生物支架材料应具备以下特点：良好的生物相容性、可降解性、足够的孔隙结构、促进细胞黏附与增殖、具备承载生长因子的能力、支架的容积应能保持不变、支架能与周围组织融为一体、不易从缺损区脱落、具有一定的弹性、具有关节软骨的分层结构。常用的支架材料有：天然生物材料、人工合成高分子材料、无机材料以及这些材料的复合物。

 

天然生物材料主要包括：胶原、明胶、纤维蛋白、壳聚糖、琼脂、糖胺多糖(如：透明质酸、硫酸软骨素等)、藻酸盐、蚕丝蛋白、松质骨骨基质、脱细胞基质等。天然支架的优势在于有利于细胞包埋，抗原性低、无毒性、无致炎性、能促进细胞生长和粘附等。但天然材料的缺点是机械性能差，一方面不适应塑性的需要，另一方面，在体内水解过程中不能保持空间构型并且吸收过快，其应用受到限制。再者，天然材料每批之间都有差别，难以大批量加工生产。

 

目前，市场上商品化的三维支架产品多以Matrigel、胶原复合物为主。胶原是天然蛋白质的一种，广泛存在于动物的皮肤、骨、软骨、牙齿、肌脾韧带和血管中，占人体蛋白质总量的30%以上，是结缔组织极重要的结构蛋白质，起着支撑器官、保护机体的功能。胶原一般是白色透明、无分支的原纤维，它的周围是由多糖和其他蛋白质构成的基质。胶原蛋白分子肽链上具有多种反应基团，如羟基、羧基和氨基等，易于吸收和结合多种酶和细胞，实现固定化，它具有与酶和细胞亲合性好、适应性强的特点。胶原具有重要的生物学性质——力学性能高、促进细胞生长、止血、生物相容性和生物降解性。已有报导，胶原可以作为移植载体用于骨介入蛋白——骨形态基因蛋白2(rhBMP2)的载运。胶原现已被广泛应用于作为传送培养好的皮肤细胞和药物的载体，以进行皮肤替代和烧伤治疗。另外胶原是一种成膜性好的物质，并具有生物相容性，在体内可被逐步吸收，因此，胶原蛋白固定化酶特别适合于人工应用材料。但其同时也存在某些缺点，诸如难以规模制备，机械强度较差，对感染部位的疗效不显著等。商品化的胶原复合物支架有牛皮、鸡爪等来源。Matrigel是从小鼠肿瘤组织中提取的抽提物, 这为三维培养介导的针对人体的干细胞临床治疗带来了风险。

 

目前常用的无机材料有羟基磷灰石、磷酸钙骨水泥、磷酸三钙等，此类材料主要应用于骨骼组织工程。

羟基磷灰石（hydroxyapatite,HA）是人体和动物骨骼的主要成分,这种材料的研究历史久远。HA脆性大、抗压性能比骨组织小，虽然植入体内后，由于组织、细胞的侵入，其强度会逐渐升高达到松质骨强度，但是有研究人员认为HA在体内吸收过慢，不利于愈合的骨骼承受应力和新骨形成。同羟基磷灰石相似，磷酸三钙(tricalciumphosphate,TCP)具有良好的生物相容性及可吸收性，但是缺乏孔隙、颗粒较小、易分解（6周）、脆性大及不耐压等缺点，限制了其应用。用磷酸钙、碳酸钙、磷酸三钙为原材料在室温下发生系列聚合反应合成磷酸钙骨水泥（calciumphosphatecement,CPC），这种化学复合物的晶体结构与天然骨相似，可以塑形，有良好的骨形态和力学特点，能够提供机械完整性。其孔隙率大约为50%，与羟基磷灰石相似，但脆性大，其降解时间较长，约需2年左右。另一方面，磷酸钙骨水泥材料内部的孔隙直径小于1mm，成骨速度慢，目前的研究重点是如何将其与大孔隙材料复合以提高吸收速度及加快成骨。

 

总的来说，此类材料具有较高的压缩强度、耐磨性和化学稳定性，并可在生物体内发生降解，被新生骨组织吸收和替代，是骨组织支架常使用的材料。但存在多孔体强度较差、加工困难、形成的支架孔隙率低、脆性大、组织不能完全长入等缺点。

 

人工合成高分子材料可以通过分子设计等手段精确的控制其性质，也可以通过化工生产得到大批量性质基本相同的产品。相对于天然材料，更利于进行标准化的生产，力学强度也较好，但是生物相容性还有待提高，目前比较常用的办法是通过表面修饰在材料表面引入生物活性因子。合成高分子材料包括聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)及其共聚物(PLGA)、聚己内酯等脂肪族聚酯，这类聚合物具有良好的可塑性，可通过模塑、挤压、溶剂浇铸等技术加工成各种结构形状，但也存在缺点：①亲水性差，细胞吸附力较弱。②易引起无菌性炎症的发生，同时聚合物降解易引起局部pH值下降。③机械强度不足。④其它：残留有机溶剂的细胞毒作用，以及可能引起的纤维化及与周围组织的免疫反应等问题。

 

目前，在人工合成的高分子材料中，PLGA的应用及研究最为广泛。其具有良好的生物降解性及生物可吸收性，它的结构通式为[-OCH(R)CO-]，体内降解的最终代谢产物为C02和H20，不在体内蓄积，没有毒副作用，能决定新生组织、器官的形状，为细胞提供获取营养、气体交换、废物排除的环境，为细胞增殖繁衍提供空间，在美国已获FDA批准并应用于临床。PGA具有高降解速度、PLA具有高强度及PLGA具有低降解速度和高药物透过性等特点，故可以在高分子设计的基础上合成一系列具有不同降解速度及力学性能聚和物，通过对材料组分、组成比、分子量、分子量分布等的控制，可以调节材料的生物降解速度在几周至几年间变化。

 

虽然人工合成的可降解高分子材料本身对细胞亲和力弱，往往需要引入适量能促进细胞黏附和增殖的活性基团、生长因子或黏附因子等。但其降解速度和强度可以调节，易构建高孔隙率三维支架。同时相比较天然生物材料，其可以在常温下保存，更简单且易操作。

 

日前，由美国3DBiotek公司新进研究出一款由聚己内酯（PCL）合成的可生物降解的三维支架，该材料已被应用于许多美国FDA批准使用的外科植入物当中。相较其他人工合成的高分子三维支架，此款三维细胞培养产品具有100%的孔隙联通性，以及可以精确控制的孔径和孔隙结构，使不同批次产品具有高度的一致性。另一方面，此款产品具有较好的抗压性，细胞可在其上进行很好的增殖、分化，是适合市场需求的一款简单易用型3D培养产品。

 

3.1 组织工程     

组织工程(TissueEngineering)是近年来正在兴起的一门新兴学科，“组织工程”一词最早是由美国国家科学基金会1987年正式提出和确定的，即：应用生命科学和工程学的原理与技术，在正确认识哺乳动物的正常及病理两种状态下的结构与功能关系的基础上，研究、开发用于修复、维护、促进人体各种组织或器官损伤后的功能和形态生物替代。组织工程的核心为：建立细胞与生物材料的三维空间复合体，即具有生命力的活体组织，用来对病损组织进行形态、结构和功能的重建并达到永久性替代。

 

成熟的软骨细胞和干细胞被广泛用于三维细胞培养，以再生损伤的软骨、骨、韧带、肌腱和膝关节半月板。在培养系统中常加入一些生长因子，以刺激分化，产生组织。Spitzer将兔造骨前体细胞在附有7.5％磷酸三钙(alpha-TCP)的血纤维蛋白内培养53天，用无alpha-TCP组作对照，结果显示这种系统能有利于体外骨的形成。Quarto等报道了应用自体骨髓间充质干细胞和羟基磷灰石构建的组织工程化人工骨修复骨缺损获得了成功。国内也有人以I型胶原及壳聚糖制备出适于组织工程皮肤构建的三维支架，其从大鼠皮肤中分离出具有稳定生物学性状的真皮成纤维细胞(Fibroblasts，Fbs)种植在该支架中进行联合培养，结果发现组织工程皮肤构建过程中，种子细胞与三维多孔支架间的相互作用类似于体内正常组织中细胞-细胞外基质间的动态相互作用。

 

利用三维技术模拟天然的心脏复杂结构仍然是医学难题，在最新的研究中，美国明尼苏达大学心血管修复中心的Doris  Taylor教授和同事采取了脱细胞化的方法，使用天然心脏的脱细胞基质做为平台制造人工心脏。研究人员首先将大鼠和猪心脏中的细胞全部移除，只留下细胞外基质做为三维支架，向其中注入新生大鼠心脏“祖细胞”（progenitor  cells），在实验室中进行体外培养，成功制成了大鼠和猪的人工心脏。四天后，观测到收缩；八天后，新心脏开始搏动。全球患有心力衰竭等严重心脏疾病的人数以万计，每年有大量的患者因得不到合适的捐赠心脏而死亡，这一成果有望为人类人工心脏制备提供新的方法，而且由于新心脏里充满了受者的细胞，所以产生排异反应的几率也会降低。此次研究也意味着应用三维培养技术也许可以人工制造任何器官，肾、肝、肺、胰腺等。

 

肿瘤细胞在一定时间、空间条件下具有特定表型，表现为特殊的结构和生长行为，它与肿瘤的发生、发展密切相关。上世纪七八十年代，科学家开始认识到微环境对肿瘤表型起着重要作用。通过研究肿瘤细胞生长的微环境可以认识特定基因改变与肿瘤细胞恶性表型间的关系。

 

传统二维细胞培养只能在二维平面上对细胞进行基因操作，可以了解到特定基因改变对细胞生物学行为的影响，却不能准确反应肿瘤发生的形态学特点。动物模型虽然可以准确地反映肿瘤发生的形态学特点，但难以进行大规模的基因操作研究，同时也不能对中间的发生过程进行实时观察。三维细胞培养结合了二维细胞培养和动物模型的优点，在体外构建与体内相近的细胞发育结构系统。因而三维细胞培养除可以模拟肿瘤细胞在体内生长微环境之外，还可以高通量地研究特定基因改变与细胞表型的关系及其生物学行为的变化过程。

 

三维培养细胞技术的先行者之一——Bissell等利用该技术成功地构建了乳腺癌上皮细胞培养模型，并在乳腺癌的研究中取得重大进展。研究发现，细胞外基质及其整联蛋白家族受体决定了乳腺上皮细胞的表型，这种作用超过了细胞的基因型对细胞表型的影响。来源于同一种系的正常乳腺上皮细胞S-1和成瘤细胞T4-2在二维培养条件下，两种细胞在形态和生长速度上差别不大。然而，在三维再造基底膜上培养时，S-1细胞呈现完整的腺泡样结构，而T4-2细胞则形成巨大的、排列松散、紊乱的侵袭性克隆。当对T4-2细胞克隆群进行B1-整联蛋白抗体干预实验，发现T4-2细胞克隆恶性表型被完全逆转，而且这种表型变化是可逆的，二维培养则无此结果。由此可见，三维细胞培养模型能辅助判断和选择特定抑制剂及其组合，以最有效地抑制特定分型的癌细胞的生长，可应用于肿瘤特异性化疗药物的设计，杀死癌细胞或阻止肿瘤的进展。

 

肿瘤细胞所处的微环境对肿瘤发生发展起重要作用。在体内，肿瘤细胞通过细胞与细胞、细胞与细胞外基质间的信号传递维持肿瘤的生长。三维细胞培养技术能模拟体内细胞与细胞间以及细胞与细胞外基质间信号传递的微环境，还可以通过技术的改进实现多种细胞的共培养及其与细胞外基质的联系。尽管在乳腺癌的研究中，三维培养模型比较成熟，但理论上每一种组织、每一种器官都具有各自独特的微环境。

 

干细胞是一类具有自我更新和分化潜能的细胞群体。近年来，生物学家们已经逐渐意识到：就细胞群体间所具有的生理及病理性作用而言，仅通过二维培养体系很可能会丧失一些宝贵的生物学信息。目前，许多研究已集中于三维培养，利用组织工程和基因工程技术对干细胞进行体外诱导和人工操作，对组织细胞损伤性疾病的替代治疗的研究备受关注。但值得指出的是，诸多报道所采用的研究体系均局限于二维平面培养体系，而实际上干细胞在体内的生长、分化微环境应为三维化体系。大量资料表明，干细胞的分化发育及其发育方向，取决于其所处的微环境(microenvironment)。越来越多的研究已表明，只有体外三维培养体系才能更好的模仿干细胞的在体生长模式，才可能为组织工程研究提供更为科学、完整的实验数据。

 

魏国峰等尝试在体外构建了一种能实现胚胎干细胞生长、分化的三维细胞模型，在该模型中以液态胶原为支架，小鼠胚胎干细胞(ESCs)为细胞模型，构建了ESCs-胶原复合体。结果表明ESCs在该胶原条带所提供的三维培养体系内不但能够保持良好的生长、增殖状态，而且彼此间能建立细胞连接，从而形成结构、功能统一体。其还对该胶原条带内ESCs能否自发性分化为心肌细胞进行了初步检测。结果表明：ESCs在胶原条带内能够分化产生心肌细胞。这些ES源心肌细胞的肌小节结构已经发育成熟，接近于新生鼠心肌细胞的结构。由此可见，三维培养体系不但能支持ESCs的增殖与分化行为，而且还利于分化细胞间彼此建立细胞连接，从而促进其组织化发育。

 

三维培养体系可以更为真实的模拟在体干细胞的生长方式，而由此所获取的相关信息将会为哺乳动物发育生物学的相关研究提供更为科学、详实的实验数据。

 

在三维培养技术的发展过程中，探索更好的生物材料至关重要，细胞在支架上的生长、移植和内生长率直接依赖于支架的多孔结构、孔隙率、孔的直径和孔的形状。高孔隙率提供细胞生长的足够空间并可促使工程化组织毛细血管网的形成，以满足其对营养物质的需求。连通的孔也是组织内生长、血管形成和养分供应的必须。孔的连通道必须大于100um，否则组织仅能侵入植入物的表面且组织内不易得到充分的养料。目前为止，仍然没有一种支架能完全同时满足目的细胞的黏附、增生、浸润、持续分化以及提供足够的机械性能，并满足在体内支架降解和基质生成相一致的要求。为促进三维培养技术的发展和应用，2003年10月美国国家癌症研究院设立专门基金研究细胞微环境，计划投入数千万美元用于发展三维培养技术。针对不同的组织、不同的应用，具体什么样的空间结构更有效，是否有更好的生物支架材料还有待进一步研究。