生长激素释放因子ELISA试剂盒

生长激素释放因子ELISA试剂盒
（美国DRG原装进口，货号：EIA3429 ）
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预期用途
此试剂盒基于竞争酶免法检测特异性多肽和相关多肽。

实验原理
微孔板预包被有第二抗体，非特异性结合位点封闭，主要抗体的Fab片段竞争结合生物素标记的多肽和标准品或样本中的目的多肽，二抗则与Fc片段结合。生物素标记的多肽与HRP-链霉亲和素反应，催化底物反应，黄色强度直接与生物素标记多肽-HRP-链霉亲和素复合物的量成正比，但是与标准品或样本中的多肽量成反比。根据已知浓度建立标准曲线，样本中未知浓度的多肽浓度可直接从标准曲线上读取。
 
试剂盒组成

20X的缓冲浓缩液，50ml

1. 微孔板，96孔
2. 封板纸
3. 主要抗血清，兔抗多肽IgG，1支
4. 标准品，1支
5. 生物素标记多肽，1支
6. HRP-链霉亲和素，30ul
7. 阳性质控，2支
8. 底物液，12ml
9. 终止液，2N盐酸，15ml
10. 坐标纸
11. 说明书

实验所需材料（但试剂盒未提供）

酶标仪（450nm）

1. 振荡器，300-400rpm
2. 洗板系统
3. 多通道移液器，50-100ul
4. 溶液贮存瓶
5. 吸水纸
6. 采血管（可选）
7. 抑肽酶，0.6TIU/ml血液（可选）
8. 缓冲液A（可选）
9. 缓冲液B（可选）
10. C18分离柱

注意：打开试剂和试验开始前先将其平衡至室温（20-23℃），强烈建议稀释过的溶液尽快使用，采血步骤见盒子内的采血说明书，每个盒子所含成分足够用于96人份检测或40人份的双孔检测。
实验步骤

实验前认真阅读说明书，所有试剂平衡至室温（大约25-45min）

1. 用950ml的去离子水稀释20X的缓冲浓缩液，得到1X的试验缓冲液，用于稀释其他试剂和样本。注意：如果20X的缓冲液出现了结晶，可在水浴锅内加热使其完全溶解，使用前彻底混匀
2. 用1X的缓冲液稀释，离心标准品，振荡。Stock solution的浓度为1000ng/ml，室温下放置至少10min，至完全溶解。使用前离心，振荡。标准品准备如下

编号          标准品的量            缓冲液的量             浓度
Stock           1000ul                ----                    1000ng/ml
#1             100ul的Stock          900ul                  100 ng/ml
#2             100ul的#1             900ul                  10 ng/ml
#3             100ul的#2             900ul                  1ng/ml
#4             100ul的#3             900ul                  0.1 ng/ml
#5             100ul的#4             900ul                  0.01 ng/ml

1. 用5ml的1X的缓冲液稀释主要抗体，放置至少5min，至完全溶解，彻底混匀
2. 用5ml的1X的缓冲液稀释生物素标记多肽，放置至少5min，至完全溶解，彻底混匀
3. 200ul的1X缓冲液稀释质控，放置至少5min，至完全溶解，彻底混匀
4. 将A1和A2孔作为空白对照（Blank）
5. 在B1和B2孔内加50ul的1X缓冲液，作为Total Binding
6. 将配制好的标准品由#5到#1各50ul依次加入至C1和C2—G1和G2孔内，注意，标准品需做双份检测
7. H1和H2孔加入50ul已稀释的阳性质控，注意，阳性质控也要做双孔检测
8. 将50ul样本加入至相应孔内，做双孔检测
9. 除空白孔外（Blank well），每孔加25ul的已稀释的主要抗体
10. 除空白孔外（Blank well），每孔加25ul的已稀释的生物素标记多肽，注意，不建议生物素标记多肽或主要抗血清加样时使用多通道移液器
11. 盖板，室温，300-400rpm下孵育2小时
12. 在3000-5000rpm下将HRP-链霉亲和素离心5秒，然后取12ulSA-HRP和12ul 1X的缓冲液混匀
13. 移取盖板，倒去反应液
14. 每孔350ul 1X缓冲液洗板4次，吸水纸上拍干
15. 每孔加100ul的SA-HRP
16. 盖板，室温，300-400rpm下孵育1小时
17. 移取盖板
18. 同步骤17）
19. 每孔加100ul的TMB底物液
20. 盖板，室温，300-400rpm下孵育1小时
21. 移取盖板，每孔加100ul的2N 盐酸终止反应。溶液颜色由蓝色变黄色，如未出现统一的颜色变化，用手轻轻拍板，使其彻底混匀，20分钟内进行下一步骤
22. 酶标仪450nm处读数

结果计算在半对数坐标纸上绘制标准曲线。标准品的浓度为X轴，相应的OD值为Y轴，用四参数或对数-对数法绘制最合适的标准曲线。浓度与OD值成反比关系，随着标准品浓度的增加，黄色强度就减少，即OD值减少
样本浓度可直接从标准曲线上读取。如果样本实验前进行了稀释，则最后结果应乘以相应的稀释因子
标准曲线为逆向S型曲线 
附：采用全自动酶标仪检测，只需检测前设置好酶标仪的相关参数，如坐标参数（线性，半对数）和计算方式参数（三次回归、四参数或双对数曲线方程），即可直接得到结果。

 贮存

收到货后贮存于4℃

1. 强烈建议尽快使用配制的试剂
2. 1X缓冲液贮存于4℃
3. 将不用的微孔板放回至密封袋内密封起来，贮存于4℃
4. 已稀释的标准品，生物标记物，抗体和HRP贮存于4℃

样本采集的建议

血液采集

用含有EDTA的采血管采集血液，每管可装7ml，采到了抗凝血液后立即摇晃几次，将血液从采血管转至含抑肽酶的离心管，不断摇晃，抑制蛋白酶活性，1600xg转速，4℃下离心15min，，收集血浆，血浆样本可在-70℃下保存1个月。如果采血管可用于离心，可直接将抑肽酶加入至采血管内。

血浆中提取多肽

1. 用等量的缓冲液A酸化血浆，如1ml的血浆加入1ml的缓冲液A，混匀，6000-17000xg下，4℃离心20min
2. 分离柱内含200mg的C18，依次用缓冲液A（3ml ，3次）和缓冲液B（1ml，1次），使其平衡

注意：步骤3-5中不能对分离柱施加任何压力

1. 将酸化的血浆倒入至预平衡的C18分离柱内
2. 用缓冲液A（3ml，2次）慢慢洗柱，倒去洗液
3. 用缓冲液B（3ml，1次）慢慢洗提多肽，收集至塑料管内
4. 用离心浓缩机或其他方法将洗提液蒸干
5. 将抽提物直接贮存于-20℃，并尽快进行试验，用1X的缓冲液直接配制。如果多肽浓度不在检测范围内，就直接进行稀释或浓缩

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