雌二醇 (E2) ELISA试剂盒使用说明

雌二醇 (E2) ELISA试剂盒使用说明

（德国DRG：EIA2693）

1、前言说明

E2是一种含一个酚A环的18C类固醇激素。此类固醇激素的分子量为272.4，它是人体中最有效的雌激素，主要由女性卵巢的格拉芬卵泡和胎盘产生，少量由肾上腺和男性睾丸产生。E2（雌二醇）被分泌到血液中，在血液中有98%的雌二醇会结合到性激素结合蛋白上，有的还会结合到其它血清蛋白上（如血清白蛋白），只有很少一部分以游离形式存在。雌激素的活性会受到雌二醇受体符合物的影响，此符合物可在靶位并在核酸水平上引发相应的反应。这些靶位包括：卵泡、子宫、乳房、阴道、尿道、下丘脑、垂体和敏感稍低的肝脏与皮肤。在月经周期正常的未怀孕女性体内，雌二醇的分泌遵循着一种循环模式，在排卵前有两个明显的高峰期。高浓度的雌二醇可在垂体水平发挥正反馈作用，它会影响垂体促性腺激素的分泌,如卵泡刺激素和黄体生成素，前者是卵泡成熟所必要的，后者是排卵形成所必要的。排卵后，雌二醇水平迅速下降直到黄体细胞被激活，结果雌二醇水平出现第二次高峰，并在黄体阶段达到一平衡述评。在怀孕期间，母体血清雌二醇的水平会极度的增加，并且会超过排卵前的峰值，而且在整个孕期维持在高水平上。血清雌二醇的检测是评价各种月经功能障碍的一个有效指标，例如女性早熟和晚熟，原发性、续发性闭经和绝经症。据报道，女性化综合征、男子女性型乳房和睾丸癌患者的血清雌二醇水平会升高。在不孕患者体内，血清雌二醇的检测有利于监测药物治疗（如克罗米酚柠檬酸盐、促黄体生成素释放激素或外源性促性腺激素）后排卵的感应情况。在因为体外受精而引起的卵巢过度刺激综合征患者中，每天监测血清雌二醇浓度以便为hCG的管理和卵母细胞的采集提供最佳时间。

2、检测原理:

   DRG公司的雌二醇酶免试剂盒是一种基于竞争法原理的固相酶免吸附实验（ELISA）。反应板上的微检测孔包被有能结合雌二醇分子上独特抗原位点的单克隆抗体。一份含有内源性雌二醇的病人样本与辣根过氧酶标记的雌二醇竞争性的结合包被板上的抗体。温育之后，未结合的酶联物用洗涤液洗去。过氧酶与包被抗体的结合量与样品中雌二醇的浓度成反比。加入底物液后，所显示的颜色强度与病人样品中雌二醇的浓度成反比。

3、试剂盒成分:

1)       包被板，12×8（可拆），96孔，微孔中包被了抗雌二醇的兔单克隆抗体。

2)       标准品：7支1.0ml/支。分别含量为：0；25；100；250；500；1000；2000pg/ml。 (1pg/ml=3.67pmol/L)

3)       酶联结物：1支，25 ml，内含辣根过氧化物酶标记的雌二醇。

4)       底物液：1支，内含，14ml ，内含TMB

5)       终止液：1支，0.5M的 H₂SO₄，14ml，避免接触终止液，以免造成刺激皮肤和着烧皮肤。

6)       洗涤液(40×)，1支，30ml

注：用于样品稀释的零标准品视需要而定。

4、实验需要器材（但试剂盒不提供）

1)        酶标仪(450±10nm)。

2)        微量移液器和吸嘴 25μl、100μl、200μl。

3)        坐标纸。

4)        去离子水。

5、试剂贮存:

   未开启的试剂在2—8℃下贮存时，其活性在有效期内稳定，不要使用过期试剂。所有开封了的试剂都必须储存于2-8℃的环境下，微孔反应板也必须贮存于2—8℃的环境下。一旦包装袋被打开，必须将它小心地严封起来。

6、试剂准备

实验开始前，将所有的试剂和所需数目的板条都平衡至室温。

洗涤液：在30ml的浓缩洗涤液中加入1170ml去离子水进行稀释，稀释好的洗涤液室温下可稳定存放2周。

7、样本采集和准备

7.1样品的采集

血清：静脉穿刺采集全血，待其凝血，室温下离心获取血清。

血浆：将全血收集到含抗凝剂的离心试管中，采集后立即离心。

7.2样品的储存

实验开始前，应当将样品用盖子盖好，2-8℃环境下可稳定存放5天。如果实验前想要将样品存放更长的时间，则应将样品冻存于-20℃的环境下。解冻的样品在实验前应反复倒置几次。

7.3样品的稀释

在首次实验时，如果血清样品中睾酮的浓度高于最高标准品中睾酮的浓度，则应将此样品用零标准品稀释10或100倍，并按实验步骤重新检测。在计算浓度时应当将此稀释因子考虑进去。

例如：

a）  按1：10的比例稀释：10μl的血清+90μl零标准品（充分混合）

b）  按1：100的比例稀释：10μl已稀释好的a）+90μl零标准品（充分混合）

8、实验步骤:

所有的标准品、样品和质控品都做双份检测以保证所有的检测条件都相同。

1)       将所需数量的板条固定到板架上。

2)       将标准品、质控品和已稀释好的样品分别用新的取样吸头取25μL加入到相应的微孔中。

3)       在每一微孔中加入200μL酶联物。

4)       充分混匀10秒，在这个步骤完全混匀很重要。

5)       室温孵育120分种。

6)       快速弃去孔内反应物，每孔用400μL洗涤液洗板3次，在吸水纸上拍干。注意：洗板步骤是否正确操作会明显影响实验的灵敏度和精确度。

7)       在每一微孔中加入100μl底物液。

8)       室温孵育15分种。

9)        加50μl终止液到每个检测孔中终止酶反应。

10)     加终止液后10分钟之内，用酶标仪在450±10nm处测定OD 值。

9、结果计算:

1)       计算每个标准品、质控品和病人样本的平均吸光度值。

2)       用吸光度值作为纵坐标（y），浓度值作为横坐标（x），以每个标准品的吸光度值对其相应的浓度值进行标绘，作一标准曲线。

3)       用每一样品的平均吸光度值在标准曲线上确定其相应的浓度。

4)        自动计算方法：在IFU上，它用四参数曲线已自动计算出结果。其它的归纳方法可能会得出稍微不同的结果。

5)        样品的浓度可直接从标准曲线上读取。样品中HPL浓度高于最高标准品的必须用进行进一步的稀释。在计算样品浓度时就应当把此稀释因子考虑进去。

10、参考值

我们强烈建议各个实验市都建立自己的正常值和异常值。在一明显正常人群的研究中，我们使用DRG公司的雌二醇ELISA试剂盒进行检测得到如下结果：

本译文仅供参考，详情请以原文为准。

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